1、ICS 71.040O657备案号： DB 52贵 州 省 地 方 标 准DB 52/ T XXXX2017草及烟草制品中多酚类化合物（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷） 测定 超高效液相色谱法Tobacco and tobacco productsDetermination of Polyphenols (neochlorogenic acid,4-O-Caffeoylquinic acid,Kaempferol 3-O-rutinoside) Ultra-High Pressure Liquid Chromatography （征求意见稿）2017 - XX - XX 发布 2
2、017 - XX - XX 实施贵 州 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DBXX/ XXXXXXXXXI目 次前 言 .II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 原理 .14 试剂 .15 仪器及材料 .26 样品制备 .27 分析步骤 .28 精密度和回收率 .39 检验报告 .4附 录 A .5DBXX/ XXXXXXXXXII前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中国烟草总公司贵州省公司提出并归口。本标准起草单位：中国烟草总公
3、司贵州省公司。本标准主要起草人：耿召良、张婕、葛永辉、向章敏。DBXX/ XXXXXXXXX1烟草及烟草制品中多酚类化合物（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷） 测定 超高效液相色谱法1 范围本标准适用于烟草和烟草制品中多酚类化合物（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷）的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法YC/T 31 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法3 原理采用 40%
4、的甲醇水溶液(V/V)提取烟草或烟草制品中多酚类化合物，提取液直接进行超高效液相色谱分析，采用紫外检测器定量。4 试剂除特殊要求外，均应使用分析纯试剂。4.1 新绿原酸含量97%（质量分数）。4.2 4-o-咖啡奎尼酸、含量97%（质量分数）。4.3 莰菲醇基芸香苷，含量97%（质量分数）。4.4 甲醇，色谱纯。4.5 冰醋酸，色谱纯。4.6 萃取溶液：40%甲醇水溶液 (V/V)。4.7 尼龙针式滤头（0. 22 m）。4.8 标准溶液4.8.1 多酚标准储备液DBXX/ XXXXXXXXX2分别称取新绿原酸(4.1)、2,4-o-咖啡奎尼酸(4.2) 50.00mg，莰菲醇基芸香苷(4.3
5、) 5.0 mg，于 50mL烧杯中，用 15mL 甲醇（4.4）溶解，再转移至 50mL 容量瓶中用 40%的甲醇水溶液（4.6）定容至刻度，作为新绿原酸、2,4-o-咖啡奎尼酸和莰菲醇基芸香苷的一级混合标准溶液。冷藏于 4 保存，有效期 3个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用。4.8.2 多酚标准系列溶液取一级混合标准溶液 1mL 于 10mL 容量瓶中，用 40%的甲醇水溶液定容至刻度，为多酚的二级标准溶。分别取二标准溶液 0.1、0.2、0.4、1mL，一级标准溶液 0.2、0.4、1mL 于 7 个 10mL 容量瓶中，用 40%的甲醇水溶液配置各级多酚系列标准溶液 。4.
6、3 流动相流动相 A：0.5%冰醋酸/水(V/V)；流动相 B：0.5%冰醋酸/甲醇(V/V)5 仪器及材料5.1 旋风式样品磨，40 目筛。5.2 分析天平，精确至 0.1 mg。5.3 超声波振荡器。5.4 超高效液相色谱仪，配置紫外光检测器。色谱柱：亚乙基桥杂化颗粒 C18 柱；规格：1.7 m，2.1 mm100 mm。6 样品制备6.1 按照 YC/T 31 制备试样并测定水分含量。7 分析步骤7.1 样品处理准确称取 0.1 g(精确至 0.1 mg)样品于置于 50mL 离心管中，准确加入 20mL 萃取溶液（4.6）置于超声波振动器中，在超声波频率 40 KHz，萃取功率 13
7、0 W 条件下超声萃取 20min，取 2mL 萃取液，用 0.22m微孔滤膜（4.7）过滤后待分析。7.2 色谱分析流速：0.25 mL/ min；柱温：30；DBXX/ XXXXXXXXX3进样量为 1 L；运行时间 10 min；流动相条件：0min：A89% ， B11%；0.3min ：A73% ，B27%；0.9min：A67%，B33%；2min：A55%，B 45%；4.0min：A55%，B 45%；4.1min：A20%，B 80%；5.4min ：A20% ，B 80%；5.5min：A89%，B 11%；紫外检测波长：0min：325nm；5min：348nm 。7.3
8、 标准工作曲线用多酚标准系列溶液（4.8.2）制作标准工作曲线。根据多酚类物质标准溶液的浓度及其响应峰面积，建立标准工作曲线，工作曲线线性相关系数应不小于0.999。7.4 样品测定按照色谱分析条件(7.2)测定样品（7.1）中的多酚类物质，根据保留时间定性，峰面积定量。每个样品平行测定两次。混合标准溶液和样品溶液色谱图参见附录 A。7.5 结果的计算与表述样品中的多酚类物质含量按照式（1）进行计算。cVX=m (1-w)（1）式中，X每克试样中的多酚含量，单位为 mg/g；c测试样品溶液中多酚质量浓度，单位为微克毫升（g/mL）；V萃取溶液的体积，单位为毫升（ mL）；m试样质量，单位为克（
9、 g）；w试样含水率，%；取两次平行测定值的平均值作为样品的测定结果，两次平行测定值间的相对平均偏差不应大于 5%，结果精确至 0.01mg/g。8 精密度和回收率本方法的精密度测定结果和回收率见表 1，2。表 1 方法的精密度 （mg/g）DBXX/ XXXXXXXXX4样品名称 新绿原酸 4-o-咖啡奎宁酸 莰菲醇基芸香苷1 2.66 3.66 0.822 2.64 3.63 0.813 2.67 3.67 0.824 2.64 3.62 0.805 2.74 3.75 0.82mean 2.67 3.66 0.82stdev 0.21 0.26 0.04RSD% 1.59 1.41 1.
10、04表 2 方法的回收率 （%）成分 样品含量 (g) 加标量( g) 加标后测定量(g) 回收率新绿原酸 267.08 384.16 662.57 104.3 2,4-o-咖啡奎尼酸 366.48 392.00 673.19 107.6 莰菲醇基芸香苷 81.61 81.44 670.49 95.9 9 检验报告检验报告应包括以下内容：识别被测样品需要的所有信息；参照本标准所使用的试验方法；检测结果，包括各单次测定结果及其平均值；与本标准规定的分析步骤的差异；在检测中观察到的异常现象；检测日期；检测人员。DBXX/ XXXXXXXXX5附 录 A（资料性附录）混合标准溶液和样品溶液色谱酚类化合物的混合标样 (a)烟样 (b)示意图如图A.1所示。AU0.120.4.360.48 分.402.83.0.64.0.4.805.2.60.1 3AU0.12.40.36.48 分2.402.803.203.604.04.04.805.205.60.012 31新绿原酸 24-o-咖啡奎尼酸 3莰菲醇基芸香苷 图 A.1：酚类化合物的混合标样(a)烟样(b)超高效液相色谱图ab
