1、第三章 病毒遗传分析,第一节 T4噬菌体第二节 噬菌体第三节 反转录病毒,1,第三节 反转录病毒,反转录病毒的结构 反转录病毒的生活周期 反转录病毒的基因组 反转录过程中DNA双链的合成和LTR的产生 病毒线性DNA整合到寄主细胞基因组 原病毒的基因表达,2,病毒组成,病毒virus,核衣壳nucleocapsid,质膜包膜 envelope,核酸Nucleic acid,衣壳capsid,+RNA+RNA,一 反转录病毒的结构,外膜蛋白（SU）,基质蛋白（MA）,衣壳蛋白（CA），二十面体,核酸结合蛋白（NC），反转录酶（RT），整合酶（IN），蛋白酶（PR）,跨膜蛋白突起（TM）,3,4,
2、5,6,7,反转录病毒的生活周期,8,9,10,Bone marrow stromal cell antigen 2,骨髓基质细胞抗原2,11,反转录病毒的基因组,12,13,反转录产生双链cDNA,14,病毒线性DNA的整合,15,16,原病毒的基因表达-转录和翻译,17,18,19,第四章 同源重组的分子机制,遗传重组的定义： 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传基因分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组(genetic recombination)。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型
3、的个体。,20,重组与杂交的关系：,重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。,21,遗传重组的类型,（1）同源重组 (Homologous recombination ) 普遍性重组（Generalized recombination）（2）位点特异性重组 (Site-specific recombi
4、nation) （3）转座（转位）重组 （Transposable recombination) （4） 特异性重组 （Specific recombination),22,Chi位点： 5GCTGGTGG 3,23,AttP核心区,24,25,二 同源重组的分子机制,1 同源重组的模型：Holliday 双链侵入模型Meselson-Raddding 单链取代模型Mzostak 双链断裂修复模型,26,Robin Holliday 1964,27,28,A同源的非姊妹染色体的DNA配对。 B-C同源非姊妹染色单体DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下，在相同位置上同时切开。D切开单
5、链交换重接， 形成交联桥结构（cross-bridged structure）。 E交联桥的位置可以靠拉链式活动，沿着配对DNA分子“传播”桥迁（Bridge migration），其中互补碱基间形成的氢键从一条链改变另一条链。于是在两个亲本DNA分子间造成一段异源双链DNA。这种结构又称为Holliday structure。 F-H绕交联桥旋转，形成Holliday结构的异构体。,29,I-J通过两种方式切断DNA单链以消除交联桥，恢复两个线形DNA分子。 K进行DNA修补合成。 I-K如果是左右切断，出现中间包含杂合双链的两旁基因是非重组 （ABab）的双链DNA分子; 如果上下切断，将
6、出现中间包含杂合双链并且两旁基因发生重组 （Ab，aB）的双链DNA分子。不管Holliday结构怎样产生，是否导致两侧遗传标记重组，它们都含有一个异源双链DNA区。,30,Meselson-Raddding 单链取代模型,31,Mzostak 双链断裂修复模型,32,2 大肠杆菌的同源重组,单链取代模型recBCD途径recF途径RecE途径,33,34,单链取代(single-strand uptake)单链入侵（ single-strand invasion）,由RecA催化单链取代。RecA有两个完全不同类型的活性：（1）在SOS反应中它能具有蛋白酶活性位点专一性、内切（2）能启动DN
7、A单链和与之互补的双链分子进行碱基配对。,35,由RecA催化单链取代 （单链同化）可发生在各种形状的DNA分子之间，但要具备3个条件(1)其中一个DNA分子要有单链区；(2)其中一个DNA分子要有游离的3末端；(3)单链区的3末端可和另一DNA分子互补。,36,37,38,1 RecA蛋白,RecA蛋白是催化重组基本反应的酶。 单链取代（单链同化） 单链同化（assimilation）是一个分子的单链侵入到另一个分子的双螺旋上，通过取代双螺旋上的原始链而形成异源双链。 当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链 上形成螺旋状纤丝。RecF、RecO、RecR等蛋白调控纤丝的
8、装配与拆分。,39,40,RecA nucleoprotein filament generated- when 50 nt in length can associate with homol duplex(wraps about the major groove)- search for homology “ss invasion” forms DNA triplex (+ATP)- nucleoprotein filament in major groove,3,RecA-mediated single strand invasion,41,42,RecA催化的单链同化,43,RecBC
9、D介导的解旋和剪切产生3游离末端的单链区，用来起始异源双链的连接.RecBCD的活性： (1) 强的核酸酶； (2) 解旋酶； (3) ATPase。,2 RecBCD蛋白,44,chi () sitesGCTGGTGGCGACCACC sites randomly every 48 = 65 000 bp actually every 10 000,45,结合双链缺口, RecBCD binds to ds break 解旋- RecBC = helicase unwind移动- moves along strand 5-3direction内切- RecD = endonuclease p
10、eriodically cuts 停顿- # chi sites - pause卸载- RecD dumped重新解旋- RecBC starts unwinding again 内切 - periodically cuts only one strand,RecBCD 蛋白,46,BC,BC,BC,47,BC,5,3,RecA coats the 3 end of ssDNA- binds cooperatively- 3nt/recA,BC,5,3,RecA,48,49,分支迁移及Holliday中间体解体,RecG是解旋酶 。介导分支迁移RuvABC介导Holliday中间体解体,50,
11、拆分重组中间体RuvA：识别 Holliday的连接结构RuvB：是ATPase,可发动迁移反应RuvC：编码内切酶, 可特异识别Holliday分枝，切割这个连接体，解离重组中间体,3 RuvABC蛋白,51,Holliday Junction Migration 涉及 几千个碱基（kbps）,Heteroduplex(may not matchperfectly),52,Twist & re-draw,Cruciform Structure,53,3D interpretation,54,Branch Migration does not occur in isolation- RuvA
12、tetramer binds/stabilises the junction- 2 tetramers in mature complex 2个四聚体- RuvB motor protein- hexameric pump (like helicase) 六聚体- dsDNA through hole- burns ATP- 2 per Holliday Junction- pump DNA 10-20 bp/sec- RuvC endonuclease resolves the structures- “resolvase”- cleaves cruciform structures- di
13、mer each monomer cleaves 1 ss DNA,55,56,RuvA tetramer binds the junction co-crystal structure,57,Cryo-EM reconstrucion,Model,58,RuvA/RuvB complex drives heteroduplex fork migration,59,RuvC cleavage either pair of strands,60,Patch Recombinant,Splice Recombinant,61,62,63,RecF途径,recB-或recC-突变后导致重组频率下降到
14、野生型的1%。所以，在sbc+菌株中99%的重组通过RecBC途径进行，只有1%通过RecF途径。外切酶I 把RecF重组途径的中间产物导向RecBC途径，因此，在recB- recC- sbcB+ 菌株中，RecF途径不能有效地发挥作用。在recB- recC- sbcB- 突变型菌株中，外切核酸酶I失活，中间产物不能转向RecBC途径，此时，RecF途径能起作用，重组频率回复正常。 (supresson of recB and recC, sbc),64,RecE途径,sbcA-突变型菌株中，多了一种不依赖ATP的核酸酶。这种酶对单链DNA只有少量活性，对双链DNA活性较高，不具有内切核酸
15、酶活性。此酶成为外切核酸酶，由recE基因编码。sbcA是其抑制基因。recB-recC- sbcA+ 菌株中，无外切核酸酶, 重组频率低。recB-recC- sbcA- 菌株中，有外切核酸酶, 重组频率回复正常,65,66,重组修复的分子机制,67,第五章 转位重组,转座因子(transposon,Tn):基因组内不必借助于同源序列就能 改变自身位置的一端DNA序列. 转座（位）重组发生在非同源序列间，不 需RecA蛋白,68,第一节 细菌转座因子的类型和结构,一 插入序列二 细菌转座子 复合转座子 复杂转座子（TnA转座子）三 细菌转座因子的插入机制、转座模型,69,1 原核生物转座因子
16、的发现,McClintock提出转座（Transposition）和跳跃基因(jumping gene)1967年Shapiro才发现了转座因子（transposable element）。 E.coli 半乳糖操纵子(gal K,T,E ）中发现了一种极性突变。 有以下的特点： (1) 能回复突变；排除缺失突变 (2) 用诱变剂对其处理并不能提高回复突变率; 他们想到galE-的突变可能也是部分DNA的插入（突变）和切离（回复突变）所致。,70,71,证实转座因子的实验：,(1) 密度梯度离心实验 (2) 分子杂交实验,72,73,dgl+/ dglm杂合双链DNA的电镜照片。,74,75,
17、2 细菌转座因子的类型,(一) 插入序列(IS) (二) 复合转座子 (三) TnA家族 (四) u噬菌体（五）接合型转座子,76,77,78,79,80,81,82,3转座机制,(1) 剪-贴型转座 (2) 复制型转座 (3) 保守型转座 (4) 接合型转座,83,剪-贴型转座,84,85,复制型转座机制,以细菌中转座子Tn3为例,说明转座的一般过程 (1979年Sharpiro提出) :A. 切开： 转座酶识别受体的靶序列，在两条单链上均切开，形成粘性末端；识别自身的反向重复序列，在3端切开。B. 连接：供体和受体结合形成不完整共联体，留下缺口。C. 复制：DNA聚合酶补齐缺口，再连接形成完整的共联体（共整合体），具有重复序列。D. 重组：在特定位点进行重组，共联体分离：留下原来的转座子；并在靶序列上插入转座子，两端有同向重复序列。,86,87,复制型转座Sharpiro Model,88,复制型转座模型能够解释：(1) 复制性转座在转座后原来的位置上保留原有的Tn；(2) 在新位置上转座子的两端出现正向重复靶序列；(3) 转座过程中出现共整合体。,89,保守型转座,90,接合型转座子,91,92,93,
