1、 【 产 品名称】 通 用 名： 人类 EGFR 基因 突变检测试剂盒 （ 荧光 PCR 法 ） 英 文 名： Diagnostic kit for Mutations of Human EGFR Gene (Fluorescence PCR Analysis) 【 包装规格 】 20 测试 /盒 【 预期用途 】 表皮生长因子受体（ EGFR）属于 I 型酪氨酸激酶受体，定位于细胞膜上。 EGFR 被表皮生长因子（ EGF）等配体激活后，将信号传导至胞内，调控细胞的生长、增殖、转化等生理过程。 EGFR 位于染色体 7p11.2， 由 原癌基因 C-erbB-1 编码， 包含 28 个外显子
2、，其中外显子 18 24 编码受体酪氨酸激酶功能区。 研究表明该区域内发生基因突变与 吉非替尼 等靶向药物的反应性相关。 这类药物的作用机制主要是通过抑制 EGFR 胞内 磷酸化而阻滞传导，抑制肿瘤细胞的增殖，实现靶向治疗。 EGFR 基因突变主要是 19 外显子的缺失突变和 21 外显子的 L858R 点突变，占突变总数的 90%以上。 19 外显子的缺失突变集中于 746-753 位密码子，其中 2 种 E746_A750del （ 2235_2249del15 和 2236_2250del15）最常见。 19，21 外显子的 这些 突变 造成 EGFR 胞内 酪氨酸激酶功能区 的结构改变
3、，提高 EGFR 与 靶向药物的 结合能力 ，使靶向药物 疗效更好。据 中国 2010 版肿瘤学临床实践指南 数据，亚洲人非小细胞癌 EGFR 突变率高达3040%， 回顾性研究报道显示，使用厄洛替尼或吉非替尼后肿瘤缓解的 非小细胞肺癌 患者大约 90%携带突变，而未缓解者则无突变 。 本试剂盒 以 人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片 提取的基因组 DNA 为检测样本， 用于 EGFR 基因19、 21 外显子多种 突变的定性检测，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对 非小细胞肺癌、结直肠癌 肿瘤 患者制定用药方案。 【 检验 原理】 本试剂盒基于实时 荧光 PCR 平台， 结合 等位基
4、因特异性扩增 （ ARMS） 技术 、野生型基因扩增 抑制技术和多重 PCR 技术 检测 EGFR 基因 19、 21 外显子的 14 种 突变 （表 1） 。 ARMS 技术 是指 PCR 引物的 3端末位碱基必须与其模板 DNA 互补才能有效扩增， 通过 设计特异性 ARMS 引物 组 （共 6 条 ARMS 上游引物 ，包括 5 条检测 19 外显子突变和 1 条检测 21 外显子突变 的引物 ）和 2 条下游 引 物 ，对 存在 突变 的 EGFR 基因 19、 21 外显子的 靶序列进行 多重 PCR 扩增， 并 利用 分别标记有 HEX 荧光 基团 BHQ1 淬灭基团 和 FAM荧
5、光 基团 BHQ1 淬灭基团 的 两条 Taqman 探针 分别实现 对 19， 21 突变外显子 扩增产物进行检测。因为人类 EGFR 基因 突变检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书 采用了野生型基因扩增抑制剂，使 ARMS 体系能够耐受更高浓度的背景野生型 EGFR 基因，降低了试剂盒对基因组样本的 DNA 浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长度与 EGFR 目标片段相似，均为 100bp 左右 ，内控探针采用标记 ROX 荧光 基团 BHQ2 淬灭基团 的Taqman 探针 对内控基因扩增产物进行检测。
6、内控引物、探针及内控基因对 ARMS 体系的扩增效率无影响。阳性对照品是 一种 扩增效率最低 的 EGFR 基因 19 外显子 L747_P753S 突变质粒与 野生型人类基因组 DNA的混合物，用于 PCR 扩增的外质控 。 表 1 本产品检测 EGFR 基因突变 外显子 突变名称 碱基变化 外显子 突变名称 碱基变化 19 E746_A750del 2235_2249del15 19 L747_E749del 2239_2247del9 19 E746_A750del 2236_2250del15 19 L747_T751del 2239_2253del15 19 E746_T751del
7、 2236_2253del18 19 L747_S752del 2239_2256del18 19 E746_T751A 2237_2251del15 19 L747_T751S 2240_2251del12 19 E746_S752A 2237_2254del18 19 L747_T751del 2240_2254del15 19 E746_S752D 2238_2255del18 19 L747_T751P 2239_2251C 19 L747_P753S 2240_2257del18 21 L858R 2573TG 【 主要 组成 成份 】 本试剂盒包含 PCR 反应液 I、 PCR 反
8、应液 和对照品等 3 管试剂。 PCR 反应液 I 包含外显子 19 突变扩增用 5+1 条 引物 对 和 1 条 探针（ HEX 标记），浓度 20100pM， 19外显子 野生型 基因扩增 抑制剂，浓度 1200pM；外显子 21 L858R 突变扩增用 1 对 引物、 1 条 探针（ FAM 标记），浓度 20100pM，和 21 外显子 野生型 基因扩增 抑制剂，浓度 800pM；内控 基因 扩增用 1 对 引物和 1条 探针（ ROX 标记），浓度 20100pM。 PCR 反应液 包含 0.1U/l Taq 酶和 50nM dNTP、 750nM Mg2+等。 阳性对照品包含 21
9、 外显子 L858R 突变质粒（ 300copies/l）、 19 外显子 L747_P753S 突变质粒（ 300copies/l）和 10ng/l 野生型人类基因组 DNA（ 3000copies/l）。 检测必须但试剂盒中不包含的组分 ： 1.5ml 离心管（用于配制 PCR 反应液和 DNA 提取）； 0.2ml PCR 管或 8 联 PCR 管或 96 孔 PCR 板； 带滤塞的 吸头（ 1ml、 200l 和 10l）； DNA 提取试剂盒 ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System（货号： A2352） 【贮存 条件及有效期 】 置于 -20条件下储存
10、，有效期 6 个月。 4-10避光条件下储存或运输不得超过 7 天。 【适用仪器】 适用于 ABI7500、 Linegene FQD-96 型号 的 Real-time PCR 扩增仪 。 【样本要求】 1. 适用样本 为非小细胞肺癌、结直肠癌 石蜡包埋病理组织切片 ，切片厚度 10m，数量 1 片， 所用切片样品保存 不 超过 3 年。 2. 由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，石蜡包埋病理切片样品 肿瘤病变细胞 应不低于 10 %，所取部分 应 尽量在蜡块中部； 3. 使用商业化的试剂盒来 提取人类基因组 DNA， 推荐使用 Promega 公司的 ReliaPre
11、p FFPE gDNA Miniprep System（ A2352）提取石蜡包埋组织切片样品， 所提 DNA 需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其 DNA OD260/OD280 的值应在 1.82.0，浓度应在 3300ng/l 之间，样本 DNA 质量不合格者不得用于检测，建议重新取切片进行核酸提取， 提取完的 DNA 建议立即进行检测，否则请于 -20以下保存 ，保存时间不要超过 6 个月。 【 检验 方法】 一、 核酸提取（样本处理室 ） 使用 ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System 进行核酸提取，提取步骤如下。 1. 用矿物油去除石蜡 加矿物油 50
12、0l 到装有组织切片样本的 1.5ml 离心管内， 80孵育 1min，振荡混 匀； 2. 组织样本裂解，消化组织蛋白质 1) 离心管内加入 200l 裂解液，室温 10,000g 离心 15s,形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相 ； 2) 向 离心管 水相加入 20l 蛋白酶 K, 用移液枪 吸打混匀 ； 3) 56孵育 1h； 4) 80孵育 1h； 5) 冷却到室温，离心 15s； 3. 去除 RNA 向 离心管 水相加入 10l RNase A，吸打混匀。室温（ 20-25）孵育 5min； 4. 用核酸提取柱提取基因组 DNA 1) 加入 220l BL Buffer 到 含
13、裂解样品 的 离心管 中，再加入 240l 乙醇（ 95-100%）， 震荡 混 匀 ，室温10,000g 离心 15s，形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相 ； 2) 将结合柱 置于 收集管内，小心吸取 离心 管 下层水相（包括可能形成的沉淀）转移到结合柱内， 盖 上管盖，将 离心管丢弃 。 3) 收集管 室温 10,000g 离心 30s， 弃去管中的滤 出 液 。 4) 把 柱子重新装入收集管中 ， 加入 500l 1 洗涤液 至柱 内 ，室温 10,000g 离心 30 s， 弃去 滤出的 洗涤液。 5) 重复步骤 4） 再洗涤 一次 ； 6) 打开结合柱盖子，室温条件下 16,0
14、00g 离心 3 min 以 甩干柱 内 残余的液体 ； 7) 把柱子转移至一个 干净 的 自备 1.5ml 离心管中，向柱内加入 50l Elution Buffer，室温 16,000 g 离心1 min 洗脱基因组 DNA，丢弃提取柱 。 注意事项： 1. 操作提取柱和收集管时应戴好一次性手套； 2. 收集基因组 DNA 前的 16,000g 离心 3 min 操作必须开盖，以除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。 二、 试剂准备 （试剂准备室） 将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀， 1000rpm 快速离心 20 秒，备用； 三、 反应体系配制 （试剂准备室） 1. 根据检测
15、样本数计算所需反应数，如样本数为 n，则需做 n+2 个反应（包含一个阳性对照 和一个无模板对照反应）； 2. 根据表 3 计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反应体系混匀后 3000rpm 快速离心 30 秒，分装至 PCR 管中， 每管 18l； 表 3 加样表 组分 1 反应 （ l） N 个反应（ l） PCR 反应液 I 14 14 N PCR 反应液 4 4 N 总体积 18 18 N 四、 加样（样本处理室） 取 2l 提取的样品 DNA 加入 PCR 反应管，盖上管盖， 1000rpm 离心或轻甩，排除管底气泡；阳性对照反应所用模板为试剂盒中对照品，空白 对照 反应所用模板
16、为超纯水（自备） 。 五、 上机检测（扩增室） 1. 将 PCR 管按顺序放入 PCR 仪，按表 4 设置反应程序； 表 4 反应程序 阶段 温度 时间 检测荧光 循环数 预变性 95 2min 1 循环段 1 95 5sec 10 52 30sec 72 15sec 循环段 2 93 3sec 35 56 30sec 60 30sec 注： 在 循环段 2 的 56时检测 FAM、 HEX、 ROX 三个通道的荧光。 2. 运行 PCR 反应程序，保存文件。 六、 结果获取 荧光定量 PCR 仪运行结束后，使用配套软件对本次试验的结果进行分析。 【 参考临界值 】 以扩增过程前 3-15 循
17、环的荧光值的 10 倍标准差为阈值，以荧光值超过阈值的循环数为阈值循环数（ Ct值）。 【 检验 结果 的解释 】 1. 空白对照应在 FAM、 HEX 和 ROX 通道均 无 Ct 值 或 无 典型的 S 型 扩增曲线升起 ；若空白对照管在至少一个通道有 典型的 S 型 扩增 曲线升起 ，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测； 2. 阳性对照应在 FAM、 HEX 和 ROX 通道均有 典型的 S 型 扩增曲线升起，且 Ct 值 12 25 间 ；若对照品有至少一个通道无 典型的 S 型 扩增 曲线升起 或 Ct 值 12 或 Ct 值 25，该批次样本需重新检测，请
18、确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行； 3. 若满足 1 和 2 要求，表 明此次实验成功，对样品管进行分析： （ 1） 内控（ ROX 通道）应有 典型的 S 型 扩增曲线升起， 且 Ct 值 1022 之间 ， 表明所加样本 DNA 质量正常； 若 Ct 值 10，表明所加样本过量，请将样本稀释后再次检测； 若 Ct 22 或 无扩增，表明所加样本DNA 含有 PCR 抑制剂或 DNA 量不够， 可能影响低突变率样本的检测结果， 请 重新提取 DNA 后检测； （ 2） 样本突变信号（ FAM 通道）有 典型的 S 型 扩增曲线升起，且 Ct 值 32，则判定该
19、样本 EGFR 基因21 外显子 L858R 突变阳性； （ 3） 样本突变信号（ FAM 通道）无 典型的 S 型 扩增曲线升起，或 Ct 值大于 32，则判定该样本 EGFR基因 21 外显子 L858R 突变阴性； （ 4） 样本突变信号（ HEX 通道）有 典型的 S 型 扩增曲线升起，且 Ct 值 32，则判定该样本 EGFR 基因19 外显子缺失突变阳性； （ 5） 样本突变信号（ HEX 通道）有 典型的 S 型 扩增曲线升起，或 Ct 值大于 32，则判定该样本 EGFR基因 19 外显子缺失突变阴性。 【 检验方法的局限性 】 1. 本试剂盒 仅适用于规定的仪器和检测系统，
20、检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治的唯一依据。 2. 本试剂盒尚无临床实验数据 证 实 EGFR 基因突变与靶向药物 用药 的相关性，其相关性主要来自文献报道 。 【产品性能指标】 1. 经 1050 例非小细胞肺癌和结直肠癌肿瘤组织样本临床试验，本品与测序法作对照，阳性符合率为99.0%，阴性符合率为 96.6%，总符合率为 97.5%。 2. 试剂盒应外观清洁、无泄漏、无破损，标志、标签字迹清楚；各组分融化后应 澄清透明，无色 ，无沉淀。 3. 检测 20 份 阳性参考品，阳性参考品符合率应为 100%。 4. 检测 10 份 阴性参考品，阴性参考品符合率应为 100%。 5. 可以检
21、出 10ng 野生型基因组 DNA 背景下，含量低至 1%的 EGFR 基因 的 14 种 突变 。 6. 用 4 份企业内部精密性参考品 分别作 10 次平行检测， 结果均为阳性且 Ct 值变异系数 CV 5%。 【注意事项】 1. 本试剂盒仅用于体外研究。实验前请仔细阅读说明书。 2. PCR 检测应在有资质的临床 PCR 实验室进行，实验室应严格按照卫生部医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法卫办医政发 2010 194 号文件规定进行资质认定和管理。 3. 实验过程中必须使用 专用的移液枪和一次性带滤 塞的加样 吸 头 。 4. PCR 操作各阶段应在不同的 分区 进行 ，分别为 试剂
22、 准备室 、样本处理 室 和 PCR 扩增 室 。人、物单向流动。 PCR 试剂盒不应存放在 样本处理 区。 5. 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。 6. PCR 操作各阶段使用专用的仪器和设备。 7. 扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。 8. 实验前及实验完毕后应该对实验室进行紫外线消毒，并用 70%乙醇擦拭工作台和微量加样器。 9. 试剂盒各组份应在有效期内使用，不同批次的试剂盒成份不得混用 【 参考文献 】 1. 高云等， EGFR 基因突变及其检测方法的研究进展，分子诊 断与治疗杂志 J， 2011， 3（ 1）：
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