1、蛋白定量分析实验实验一 双缩脲法测定蛋白质含量一实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。二实验原理在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与 Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应） ，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于 520nm 下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。三实验仪器及试剂容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿试剂：标准酪蛋白溶液 10mg/ml双缩脲试剂: 溶解 2.5g CuSO45H2O 于 100ml 水中
2、，加热溶解，取酒石酸钠 10g、碘化钾 5g，溶于 500ml 水中，再加 5mol/L NaOH 溶液300ml混合，倒入硫酸铜溶液，加水至 1000ml小鼠肝脏蛋白原浆四实验内容（1）取小试管 7 支，编号，按下表注入溶液（2）混匀后，于 37水浴中保温 15min，在 520nm 波长下比色，以第 6 管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。（3）按表中第七管的数据加入溶液，在 37水浴中放置 15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每 100ml 小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。五.实验数据记录及结果分析绘制曲线如下：管号试剂（ml）1 2
3、 3 4 5 6 7标准蛋白质溶液 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 原浆 0.1生理盐水 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.9双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0管号1 2 3 4 5 7吸光度 0.069 0.238 0.390 0.528 0.659 0.107由图可知，当吸光度为 0.107 时，相对应的蛋白质克数为 1.38 mg，则100ml 小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为 1.38 g。实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一实验目的掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。二实验原理考马斯亮蓝在
4、游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，结合物在 595 nm 波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。三实验仪器及试剂仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿试剂：考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50 ml 95%乙醇中，加入 100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 ml。标准蛋白溶液 500g/ml50 倍稀释后的小鼠肝脏蛋白原浆四实验内容（1）取试管三支，按下表操作：（2）混匀，室温放置 5min，在波长 595nm 处调零，测定各管吸光度值。五实验数据记录及结果分析测得标准管与样品管的吸光度分别为 0.4
5、18，0.222试剂（ml） 空白管 标准管 样品管生理盐水 0.1 - -标准蛋白溶液 - 0.1 -样品 - - 0.1考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.000.0690.2380.000;Re300.0000.5280.6590 2 4 6 8 1000.10.20.30.40.50.60.7蛋 白 质 克 数/mg吸光度则 样品中蛋白质的含量 g/ml=(0.222/0.418)500=265.6g/ml则 稀释前小鼠肝脏蛋白原浆中蛋白质的含量为 13.3mg/ml。实验三 紫外分光光度法测定蛋白质含量1实验目的掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。
6、2实验原理蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸，使蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。3实验仪器与试剂试剂：标准蛋白质溶液 1mg/ml30 倍稀释后的小鼠肝脏蛋白原浆仪器：紫外分光光度计，吸量管，试管，比色皿4实验内容280nm 的光吸收法（1）取试管 7 支，按下表操作：管号试剂（ml ）1 2 3 4 5 6 7标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 - 原浆 1.0生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 3.0（2）混匀后，在石英比色皿中，用紫外分光光度计，以第 6 管调零，在280nm 下测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线五实验数据记录及结果分析绘制曲线如下：管号1 2 3 4 5 7吸光度 0.149 0.267 0.323 0.476 0.570 0.23600.1490.2670.3230.4760.570 0.1 0.2 0.4 0.5 0.6 0.800.10.20.30.40.50.6蛋 白 质 浓度mg/ml吸光度由图可知，当吸光度为 0.236 时，相对应的蛋白质浓度为 0.243 mg/ml，则稀释前小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质浓度为 48.6mg/ml
