1、实验方案范例备注：红色字体部分请根据实验实际条件修改。一、基因操作1、基因 A（GeneA）的敲减载体构建版本 1：针对 GeneA，在 Sigma 网站上搜索已验证过敲减效率的 shRNA 序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链 DNA oligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA 表达框架。以 EcorI 和 BamHI 内切酶酶切 pGP 载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。将 shRNA 表达框架插入 pGP，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行 PCR 鉴定与测序，构建含有针对 GeneA 的 shRNA 骨架质粒。版本 2：从 Genebank 调取人 GeneA 核苷
2、酸序列，利用 Ambion 数据库软件设计针对 GeneA 的有效的 shRNA 序列，经 Blast 比对进行同源性分析后，选出特异性较高的 3 组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。取 pGP shRNA 载体 15L 于 EP 管， 用 BamHI 1.5L 与 EcoRII 1.5L、10buffer 5L 酶切反应 4 h 以上；产物回收加入 T4 DNA Ligase 使 GeneA shRNA 片段与目的载体连接，连接产物加入至 DH5感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行 PCR 鉴定、DNA 测序。2、GeneA 过表达载
3、体构建从 Pubmed Nucleotide 数据库中检索针对目的基因的 CDS 序列，将序列导入DNAMAN 软件中，进行酶切位点分析；在该序列中不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶EcoRI 和 SacII。引物直接在 GeneA CDS 编码区起始和末端设计，然后在引物的 5端加上相应的酶切位点。以 cDNA 为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理片段并纯化回收。以同样的酶切位点处理 pCDH 载体以使其线性化，胶回收载体后与片段连接并转化 DH5感受态细胞，通过 PCR 鉴定阳性克隆并测序。3、GeneA 点突变载体构建版本 1：
4、根据突变位点特异性设计突变寡核苷酸引物并合成含突变位点且互补的两条引物。在 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下，合成整个含有突变位点的质粒。在反应液中加入 Dpn I 显著性内切酶， 37 1 h。Dpn I 只能切断腺嘌呤甲基化的 DNA， 能将含有甲基化的原始模板消化，留下没有甲基修饰的突变质粒。将反应液转化入感受态大肠杆菌。PCR 所得的突变质粒的缺口能在大肠杆菌中得到修复，所获得的菌落即含有突变质粒。版本 2：使用 Hieff Mut Site-Directed Mutagenesis Kit 定点突变试剂盒构建GeneA 点突变载体。针对需引入突
5、变的区域设计含突变位点的引物，将质粒进行反向 PCR 扩增，扩增产物与 DpnI 混合，置于 37 恒温反应 12 小时进行消化，去除甲基化模板质粒。配制含有 Exnase 的单点突变重组反应体系。置于 37 反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。取 20 l冷却反应液，加入到 200 l感受态细胞中进行转化，随后取 100 l菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，长出来的阳性克隆 PCR，测序鉴定。4、GeneA 敲除载体构建（CRISPR/Cas9 法）从 NCBI 数据库中查询 GeneA 的 CDS 序列，在外显子中确定待敲除的序列，选择 23-2
6、50bp 的外显子序列输入软件中，进行特异 sgRNA 设计，根据输出的 sgRNA模板序列，合成一对序列互补的 DNA Oligos。将合成的 Oligos 以逐步降温的方法退货成双链，然后与 Cas9 质粒进行连接，转化 DH5感受态大肠杆菌细胞，涂板，阳性克隆测序，正确的阳性克隆，小抽后获得含 shRNA 表达元件的 Cas9 质粒。错配酶法检测剪切活性：靶序列 PCR 扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（ CEL1 或T7E1 酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，判断 Cas/sgRNA 的活性。二、病毒包装1、慢病毒包装使用 Clontec
7、h 公司的 Lenti-XTM HTX packaging System 第四代慢病毒包装系统。转染前约 24 hr，以 4-5106 Lenti-X 293T 细胞/100 mm 板的密度接种 10 ml 细胞，培养过夜。按照说明书，将致力 DNA 转染体系和 polymer 体系分别混匀，再将两者混合后室温孵育 10min 后滴加至 293T 细胞中，十字形摇晃混匀。4 小时候换液，继续培养 48 小时，收获病毒上清，500g 离心 10min 去除细胞碎片，冻存于-80待用。Lenti-X GoStix检测病毒滴度或者按照梯度稀释法，转染 293T 细胞，根据感染效率判断滴度。2、腺病毒
8、/腺相关病毒包装取 5g重组质粒用 PacI 酶切然后胶回收大片段，用 TurboFect TMin vitrotransfection Rengent 以 2g每孔（6 孔板）转染融合度为 80-90%的 293T 细胞包装病毒。转染后 24 h，在荧光显微镜下观察绿色荧光数量与分布情况，以跟踪腺病毒的包装与增殖过程；转染 6-8 d，局部出现绿色荧光葡萄串样聚集现象；转染 10-12天，大量细胞病变变圆脱壁，出现明显的空斑，待约 50%细胞从培养容器底部脱落时收集全部培养液与细胞至离心管中，将细胞悬液于-80/37反复冻融并涡旋振荡 2 次，5000g 离心 5 min，收集上清液，即为第
9、 1 代病毒悬液。用第 1 代病毒悬液侵染融合度约 90%的 293细胞，2-3 天后，细胞出现病变，开始变圆脱落，待脱落 50%左右，收集细胞按前述方法收集上清液，即为第 2 代病毒悬液。用第 2 代病毒悬液再次侵染 293T 细胞，重复“ 侵染冻融收集” ，以大量扩繁病毒和提高病毒滴度。将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定病毒滴度。三、细胞功能检测试验细胞预处理（以用敲减基因研究基因对细胞增殖为例）：细胞以 50000 个/孔接种于 6 孔板，实验分组：空白对照阴性对照实验组。37 ，5%CO 2培养过夜后，换上 OPTI-MEM 培养基，同时加入根据 MOI 计算所需
10、的病毒量，轻轻摇匀后继续培养 4 天，期间在荧光显微镜下观察绿荧光表达效率。1、细胞活性检测1）MTT 实验消化细胞并制成单细胞悬浮液，以 2000 个/ 孔的密度于 96 孔板中接种，每组设置5 个复孔，连续检测 5 天。检测前，每孔加入 20l 5mg/ml 的 MTT（PBS 配制，pH=7.4） ，与 37 中孵育 4h，小心吸去上清液后，每孔加入 150lDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。然后在酶标仪上，读取 490nm 波长的吸光值。2）CCK8 实验使用 Cell Counting Kit（CCK8）CCK-8/WST-8 试剂盒：消化细胞并制成单细胞悬浮液，以 200
11、0 个/孔的密度于 96 孔板中接种，每组设置 5 个复孔，连续检测 5 天。检测前，每孔加入 10l CCK-8 试剂，37 避光孵育 2 h；然后将孵育后的培养基移到酶标板中，450 nm 处用 BIO-RAD 酶标仪测定的吸光度。3）Brdu 实验细胞以 1.5105个/ml 细胞量接种于六孔板中（内放置一盖玻片） ，每组设置 3 个复孔，培养 1 天，用含 0.4FBS 培养液同步化 3 天，使绝大多数细胞处于 G0 期。加入 BrdU（储液： 1.0 mg/ml，终浓度为 0.03 g/ml） ，37，孵育 40min。吸去上清，盖玻片用 PBS 轻轻洗涤 2-3 次，置于甲醇中固定
12、 10min 后在空气中干燥，0.3 H2O2-甲醇 30 min 灭活内源性氧化酶。随后用 5正常兔血清封闭，甲酰胺100， 5 min 变性核酸，冰浴冷却后 PBS 洗涤，加 1 抗即抗小鼠 BrdU 单抗（工作浓度 1：50 ） ，阴性对照加 PBS 或血清。按 ABC 法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数 10 个高倍视野中细胞总数及 BrdU 阳性细胞数，计算标记指数。2、克隆形成1）平板克隆（贴壁细胞）细胞以 500 个/孔的细胞量接种于六孔板中，十字形手法摇匀，每组设置 3 个复孔，37，5% CO2中培养。每隔 2 天在显微镜下观察克隆的大小，每隔 3 天换上新的培
13、养液。待大多数单克隆中的细胞数大于 50 的时候，在荧光显微镜下拍照。随后吸去培养液，用 PBS 小心洗涤一次，每孔加 0.1 ml 10甲醇溶液固定细胞 30 秒钟。吸去甲醇溶液，每孔加 0.1 ml 结晶紫染液，室温中放置 20 分钟。轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或 37烘干。2）软琼脂集落形成（悬浮细胞）细胞消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为 1000 个/ml 。制备底层琼脂，完全溶化的 5%琼脂和 37 左右预温的细胞悬液以 1：9 比例在 40 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含 0.5%琼脂培养基 2ml，室温下琼脂
14、完全凝固。制备上层琼脂,取 37 不同密度梯度( 按照每皿含 50、100、200 个)的细胞悬液 1.5ml 移入小烧杯中，加入 40 、 5%琼脂等体积混匀，即成 0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37 、5%CO 2静置培养 2-3 周后观察克隆形成情况。3、细胞周期细胞以 30%的密度接种于 6cm 培养皿中，48 h 后用胰酶消化细胞，收集样品；12,000 rpm 离心 5 min，收集细胞，弃上清；用预冷的 PBS 洗涤两次，加入预冷的70%乙醇，于-20 固定过夜； 1,500 rpm 离心 5 min，弃上清，
15、用 3 ml 的 PBS 洗涤一次；加入 250 l 的 100 g/ml 碘化丙啶（propidium iodide, PI） ，250 l RNase A（ 100g/ml ） ，4 避光孵育 30 min；上流式细胞仪前以 200 目尼龙网膜过滤细胞，以防细胞团聚堵塞流式细胞仪；采用 Beckman 流式细胞仪分析样品，计数 2-3 万个细胞；流式细胞仪结果用细胞周期拟和软件 Flowjo 进行分析，每组实验独立三次重复。4、细胞凋亡1）AnnexinV/7-AAD 流式使用凯基公司 KGA1026 试剂盒。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm，3min 离心，吸
16、去上清，用 PBS 洗 1 遍，离心后用 PBS 重悬细胞，进行细胞计数。取 1E+5 个细胞量的悬液，离心弃上清，加入 500 l Binding buffer 重悬细胞。加入 5 L Annexin V-APC，混匀后，再加入 5 L 7-AAD 染液，混匀，室温，避光，反应 5-15 min 后置于冰上。1 小时内进行流式细胞仪机检测。GFP 的绿色荧光：FITC 通道筛选 GFP 阳性细胞进行 Annexin V-APC7-AAD 荧光检测。Annexin V-APC 的红色荧光：激发波长 633nm，最大发射波长 660 nm。7-AAD 红色荧光：激发波长 Ex=546 nm；发射
17、波长 Em=647 nm。2）DAPI 染色培养的单层细胞 (未固定)或新鲜组织的冰冻切片等，PBS 漂洗 5 分钟；DAPI 工作液（DAPI 储存液：将 0.5mgDAPI 溶于 5ml PBS 中，分装，低温长期保存；DAPI 工作液：用 PBS 稀释 DAPI 储存液，终浓度为 0.1ugml）室温染色 520 分钟(可根据实验材料的染色结果而定)； PBS 漂洗；水溶性封片剂封片，游离细胞也可直接用含DAPI 的 PBS 封片；最后进行荧光显微镜观察：正常的细胞核呈强荧光，细胞质无荧光；固定的组织细胞同样处理，亦可得到相似的染色结果。5、细胞运动1)细胞划痕实验消化细胞，按照 80%
18、的密度，接种于 24 孔板，每组设置三组重复。细胞培养过夜后，用预先灭菌的细竹签或枪头在孔的中部横向划伤一个区域，确保每一组划伤的区域大小一致，用 PBS 洗去漂浮的细胞，加入新鲜培养基。每隔 24 h 进行一次显微拍照，第一次拍照时作好记录，以后每次观察和拍照记录同一区域细胞生长的状态。照片用IPP 统计软件对愈合前后的划伤区域面积进行统计，比较不同组之间愈合的速度，以此判断细胞的运动能力。2）Transwell 小室（Corning，3422 ）迁移实验/matrigel 预制 Transwell 小室（BD ，354480）侵袭实验实验前，实验细胞用无血清培养基进行饥饿培养 12-24h
19、。用胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm 离心 3min，吸去上清，用 PBS 重悬细胞清洗细胞 1 遍，离心弃上清后用含 0.1%BSA 的无血清培养基重悬细胞，并进行细胞计数。用含 0.1%BSA 的无血清培养基调整细胞密度至 1E+5/ml（不同细胞所需细胞密度不同） 。于 24 孔板中加入 500 L完全培养基(下室培养基血清浓度不同细胞会有所不同)；Transwell 小室（以下简称小室）内部加入 200 L 细胞悬液；用镊子将小室小心转移至含有完全培养基的24 孔板孔中，避免出现气泡；将 24 孔板轻轻放进细胞培养箱（5%CO2，37）中培养 24h（不同细胞所需时间不同） ；
20、轻轻吸去上室培养基，用 PBS 润湿后的棉签轻轻擦去上室内的细胞；将小室底面浸入 10甲醇溶液中固定细胞 30 秒钟，转移至纯净水中，把甲醇洗掉，再把小室底面浸入结晶紫染液中染色 20min，用纯净水清洗至背景清晰。镜下随机选取 5 个视野，计数穿过膜细胞数。每个小室中加入 100l 33%醋酸，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液在酶标仪上 570nm 测其 OD 值。6、细胞衰老使用碧云天 -半乳糖苷酶染色试剂盒（ C0602）进行检测，步骤如下：预处理的细胞，按照 40%的密度，接种于 24 孔板。待细胞生长 3-4 天后，吸去上清。用 PBS洗涤 1 次加入 1 毫升 -半乳糖苷酶染色固定液，
21、室温固定 15 分钟。吸除细胞固定液，用 PBS 或 HBSS 洗涤细胞 3 次，每次 3 分钟。吸除 PBS 或 HBSS，每孔加入 1 毫升染色工作液。使用聚丙烯(polypropylene)容器，不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制染色工作液。37孵育过夜，可以用 parafilm 或保鲜膜封住 6 孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察并计数，被染成深蓝色的细胞即为衰老阳性细胞。四、研究模型的建立1、新鲜组织分离原代细胞新鲜手术取得或冻存的组织于 37 快速复温，原代细胞培养工作液清洗 3 次，尽量修剪去除纤维组织，将组织块剪成约 1 mm3大小的小块，弯头吸管吸取组织块均匀
22、种植于 75 cm2 培养瓶瓶底，瓶内加入少量原代细胞培养工作液，小心翻转培养瓶使组织块黏附于瓶底，置于 37 、5% CO2培养箱中培养 6-8 h，待组织贴壁后，正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。每日定时观察细胞生长状况，记录细胞生长满瓶时间，并收集培养细胞送病理学检查。酶消化法纯化肿瘤细胞：当组织块培养 15-20d 后，组织块（包括无活性的肿瘤细胞、破碎细胞和成纤维细胞等）自动脱落。取出培养瓶，弃掉培养基和漂浮的组织块，用 5 mL PBS 洗涤一次。加 1.5 mL 0.25%的胰酶，前后旋转培养瓶 4-5 次，使胰蛋白酶包被所有瓶内细胞，放入 37 细胞培养箱中 2 min。取出
23、培养瓶在倒置显微镜下观察，可见部分细胞首先变圆、脱落被消化下来，这时停止消化。这些首先被消化下来的细胞为成纤维细胞，吸除成纤维细胞及消化液。加入 5 mL 培养液，用吸管吹打细胞，收集细胞悬液。离心后弃上清。加入 PBS 洗涤细胞沉淀，再离心弃上清，再加入培养液后接种于培养板中继续培养。机械刮除法纯化肿瘤细胞：用不锈钢丝末端插橡胶刮头或裹少许脱脂棉制成，高压灭菌后备用。用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜下，刮除无标记空间；再用 PBS 冲洗 1-2次，洗除被刮掉的细胞；继续培养，如发现成纤维细胞残留，重复刮除至完全除掉为止。2、细胞
24、分选（以分离肿瘤组织中的 CD133+细胞为例）1）流式分选无菌条件下收集肺癌病人手术中切除的肺癌肿瘤组织，用 PBS 缓冲液清洗组织 2次，利用眼科剪去除组织中的坏死部分和血管等，将肿瘤组织块浸泡于 5 倍体积的peniclillin (1 000 U/mL)和 streptomycin(1 000 U/mL)混合液中 10 min。弃抗生素，将肿瘤组织剪成 1 mm1 mm1 mm 左右的组织小块，然后加入 5 倍体积的胰酶消化液(0.25%胰酶含 0.02% EDTA)，于 37 环境下震荡消化 30 min。随后，加入 5 倍体积的含 10%胎牛血清的细胞完全培养基加以终止，上下颠倒震
25、荡使细胞脱落，过200 目筛网，于 1500 r/min 离心 5 min。收集细胞沉淀，加入 100 L预冷的 PBS 缓冲液，随后加入 rabbit anti-human CD133-FITC monoclonal antibodies 各 4L，并于 4 环境中避光孵育 30min。利用流式细胞仪(BD FACSAria，BD Bio-science，CA ，USA)将 CD133+和 CD133-分选出来，并悬浮于无血清的干细胞培养基动物实验培养基中，37、5%CO 2培养。2）磁珠分选组织消化为细胞同上，获得的细胞用分选缓冲液洗涤，以 800 g 速度离心 3 min 弃上清，将沉淀
26、加入 300L 分选缓冲液混匀，再加入 100L CD133 免疫磁珠，混匀后 4避光孵育 30 min，再加入缓冲液洗涤，以 800 g 速度离心 10 min，弃上清，再用缓冲液重悬细胞。先用 500 L缓冲液冲洗分选柱，将细胞悬液过柱。缓冲液洗分选柱 3 次，移柱出磁场。1 mL 缓冲液洗柱，用泵加压，收集洗液即为 CD133+细胞。五、机制研究1、高通量筛选1）基因芯片/蛋白芯片GeneA shRNA 慢病毒感染细胞 6 天后，TRIzol 裂解后吸出小部分，进行 qPCR检测，验证敲减效率。其余样品冻存与-80后送芯片公司（*公司）进行* 芯片检测。样品实验分组：阴性对照组、实验组。
27、检测结果通过标准化处理，差异筛选后，进行 GO 分析、pathway 分析，筛选出 GeneA 敲减后，变化最大的信号通路。2、蛋白- 蛋白相互作用1）酵母双杂筛选目的基因相互作用蛋白（以文库筛选为例，也可进行一对一验证）通过 PCR 方法扩增 GeneA 基因 cDNA 片段，克隆进入 pGBKT7 载体，构建pGBKT7-GeneA 诱饵质粒；将被诱饵质粒转化的 AH109 分别涂布于 SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade 和 SD/-Trp/X-Gal 平板上，以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因；确认没有自激活，就可将已被诱饵质粒转化的 AH109 与预转染
28、于 Y187 的人类肝 cDNA 文库进行酵母双杂交，分离阳性克隆中的 cDNA，并测序。所得序列与数据库进行对比，获得与 GeneA 有蛋白相互结合作用的候选分子。2）Co-IP( 以一对一验证为例，也可与质谱联用进行筛选)将欲验证相互作用的 2 个分子（A 和 B）分别构建表达载体并共转染 293T 细胞。转染后 24-48 h 后收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂） ，冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4， 最大转速离心 30 min 后取上清；取少量裂解液以备Western blot 分析，剩余裂解液加 1g GeneA 的抗体， 4 缓慢摇晃孵育过夜；取10l pro
29、tein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3,000 rpm 离心 3 min；将预处理过的 10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4缓慢摇晃孵育 2-4h，使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在 4 以3,000 rpm 速度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml 裂解缓冲液洗 3-4 次；最后加入 15l的 2SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟，分别用 A 和 B 的抗体进行 Western Blot 检测。3）GST-pulldown方案 1：已知目的 GeneA，欲寻找 A54
30、9 细胞中与 GeneA 有相互结合作用的未知蛋白（GST-pulldown 结合质谱技术）构建 GeneA 的带 GST 标签表达载体，转染至 293T，48 小时后收集细胞，裂解、蛋白定量。A549 细胞蛋白裂解液用 GST-谷胱甘肽琼脂糖珠子于 4孵育 2h，以去除非特异性结合蛋白，孵育后于 4，800g 离心 5 min 后取上清。根据 293T 蛋白浓度，加入过量 GST-谷胱甘肽琼脂糖珠子以及预处理后的 A549 蛋白裂解液，于 4 孵育过夜。离心 5 min 收集沉淀并用 1 XPBS（含 0. 5% TritonX-100）洗涤。沉淀加入 2X 电泳上样缓冲液于沸水浴 10 m
31、in 裂解，10%分离胶的 SDS-PAGE 分离，考马氏亮蓝染色显示蛋白质条带。切取蛋白质条带进行酶解。蛋白质条带用双蒸水冲洗 2 次，加入 100ul 新配制的脱色工作液(50% 乙腈，25mmol/L NH4HCO3)，37水浴 30min，直至蛋白质条带呈无色透明。加 50%乙腈脱水直至胶块完全变白后再进行还原烷基化，即加入 80ul 10mmol/L DTT，57水浴 1h，吸去多余的 DTT 后加 80L6mmol/L IAA 置于暗处反应 45min。25mmol/L NH4HCO3吸胀并加 50%乙腈脱水，最后置于真空干燥器中冷冻干燥。加入胰蛋白酶酶解 16h，吸出含肽片段的上
32、清后在胶块上加 40ul 萃取液(100%乙腈，5%TFA)，超声辅助提取两次，合并萃取液和吸出的上清液体后冷冻离心干燥。冻干后的样品用 35L 样品溶解液（ 0.1%甲酸，50%乙腈）溶解， 12000g，12min 离心，取上清用德国 Bruker 公司的 HCT 仪器进行质谱分析。 质谱数据分析主要采用本地化的 Mascot 程序，使用 MatrixScience 网站（http:/）提供的 IPI_rat_3.26RAT_v3.26 进行检索。检索时，可接受的肽段相对分子质量误差为 0.6。氨基酸固定修饰方式选Carbamidomethyl(C)修饰，可能的修饰方式选 Oxidatio
33、n(M)修饰。本地运行的Mascot 数据库查询结果的有效值为 39 分以上。方案 2：已知目的 GeneA 和 GeneB，验证 A 和 B 是否有相互结合作用（GST-pulldown）分别构建 GeneA 的带 GST 标签，GeneB 带 His 标签表达载体，将这两个载体共转染入 293 细胞，48 小时后收集细胞，裂解。取 50-70ul GST-Beads（Immobilized Glutathione）到 EP 管中，用 800ul PBS+1%Triton-100 润洗一次，将 293 细胞裂解液与之混匀，4孵育 1 小时，离心收集沉淀，用 PBS+1%Triton-100
34、洗 3 次，PBS 洗3 次。40ul 5loading buffer 溶解 beads 上的蛋白，煮沸 3 分钟，高速离心，然后分别用 GST 和 His 抗体进行 Western Blot 检测，以裂解液和 GST 空载体分别作为阳性、阴性对照。3、DNA-蛋白相互作用: 染色质免疫共沉淀技术(ChIP-PCR)将 GeneA 表达载体转染 293T 样品（10cm 培养皿） ，加入 37%甲醛（终浓度为1%） ，37孵育 10min 后加入甘氨酸终止交联。吸去培养基，PBS 洗涤 2 遍，用细胞刮将细胞收集于 15 ml 离心管中，预冷后离心去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis
35、Buffer，超声破碎，离心取上清 300l（其他冻存于-80） ，分成 3 组：100ul 加GeneA 抗体作为实验组；100ul 不加抗体做为对照组； 100ul 加入 4ul 5M NaCl（ NaCl 终浓度为 0.2M） ；65 处理 3 小时解交联，跑电泳，检测超声破碎效果。加入 900 ul CHIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50PIC。再各加入 60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4颠转混匀 1 小时，4静置 10 分钟沉淀，700rpm 离心 1 分钟。取上清。各留取 20ul 作为 Input。一管
36、中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4颠转过夜。加入 60ul Protein A Agrose/Salmon Sperm DNA。4 颠转 2 小时。4静置 10 分钟后，700rpm 离心 1 分钟。除去上清。缓冲液清洗沉淀复合物后进行洗脱。管中加入 20ul 5M NaCl，混匀，65 解交联过夜。解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA (MBI)，37 孵育 1 小时。每管加入 10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl(pH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45 处理 2 小时。DNA 片段的回收omega 胶回收试剂盒。最终的样品溶于
37、 100 ul ddH2O。设计引物进行PCR 鉴定。4、RNA-蛋白相互作用：RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP-PCR ）将 GeneA 表达载体转染 293T 样品，消化细胞，离心去上清。加入 polysome lysis buffer 进行裂解。冻融后离心，上清转移至新的 EP 管中。Sigma beads 置于1.5mlEP 管中， EP 管置于磁力架上，吸去上清，加入封闭液进行封闭 3h，去掉封闭液后，加入 IP solusion 重悬 beads，平分至 2 个 EP 管中，分别加入细胞裂解上清。置于磁力架上 10 数秒后，吸出一点上清作为 input mRNA，加入 TRIzol
38、 置于室温。其余含 beads 的 IP solution 置于 4混合仪翻转 4h，然后将 EP 管置于磁力架上 10 数秒后，吸去全部上清，并用缓冲液洗 beads4-5 次后，加入 TRIzol，这部分为 output。将 input 和 output 两部分样品用氯仿抽提 RNA，反转录后，设计引物进行 PCR 鉴定。六、动物实验-裸鼠成瘤细胞准备：GeneA 敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分组，阴性对照组，实验组。订购裸鼠（上海斯莱克实验动物有限公司，Balb/c 裸鼠，雄性，6 周龄。每组 10只） ，适应一周后进行注射：细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用P
39、BS 悬浮，在 Balb/c 裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种 2E+6 个细胞，注射体积为100L。此后，每隔 5 天测量注射部位肿瘤的体积。30 天后裸鼠小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，80mg/kg，待小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上） ，小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一分4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一分-80冻存。对于转移模型，还需要打开腹腔，统计转移灶结节数量，并置蓝色背景布上拍照。将转移灶一分为二，一分 4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一分 -80 冻存。4%多聚甲醛固定后续用石蜡包埋，制成石蜡切片，用于免疫组化。-80 冻存
40、样品进行总蛋白抽提，用于 Western Blot 检测。七、免疫组化收集临床病理样本：收集临床病理和随访资料齐全的 200 例*癌症患者样本，分组根据不同 TMN 分期。一部分组织制作石蜡块用于组织微阵列芯片检测；另一部分新鲜组织用于总 RNA 抽提，并反转录为 cDNA。通过免疫组化检测 GeneA 在*癌组织芯片中的表达情况：根据临床病理资料和治疗、预后数据，分析 GeneA 的表达与肿瘤的临床症状（包括药物缓解率（response rate, RR） ，疾病控制率(disease control rate, DCR)，无进展生存期（progression-free survival, PFS）和总生存期（overall survival, OS） ）及其他临床病理特征之间的相关性。使用 SPSS 17.0 软件进行数据统计分析。反转录获得的 cDNA，进行 real-time PCR 检测：确定组织样本中 GeneA 以及其他下游分子的 mRNA 表达水平。结合临床病理资料，分析 GeneA 在不同恶性程度的*肿瘤 中表达差异，同时验证其通路机制中的相关分子。
