1、临床免疫学实验指导 检验医学院 免疫学教研室 吴荣泉 13036095326,实验二、 单向琼脂扩散试验,【实验原理】将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中 加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在比例适宜时形成白色沉淀环. 沉淀环直径与抗原含量成正比。 用标准抗血清和已知浓度的抗原（或国际参考品）制成标准 曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗原的含量。 本试验主要用于检测标本中各种Ig、补体的含量等，具有高灵敏性，高特异性特点。,【实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用,【试剂与器材】1. 羊抗人IgG血清（兔
2、抗人血清，购买）2. 标准参考血清(标准IgG质控物，购买)3. 待检人血清（IgG抗原）4. pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）5. 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）6. 载玻片、打孔器、 37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等,用于制作 标准曲线,【操作注意事项】 1. 制备抗体琼脂板 琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性 2. 加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致 3. 加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察 4. 加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头 5. 检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作 6. 孵育时间应控制在
3、37，24-48小时，时间太短或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。,【标准曲线的制备】由实验教师,1. 购买标准已知浓度的 人血清（IgG抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人） 抗人IgG-抗体（抗血清）2. 制备1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记）取琼脂粉1.0g，加NS，100ml.混匀加热溶解成透明液体，放56，加入标准抗血清1.01.5ml，混匀，制板3. 制板，打孔，孔径3mm，孔距1.2-1.5cm，打5个孔。4. 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10L110， 120， 140，180， 1 :160. 稀释100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg
4、 ，6.25mg. 浓度5. 保温反应：将凝胶板放湿盒内，37反应24h,观察结果.6. 用坐标纸制作标准曲线:以沉淀环直径（m m）为纵坐标;以标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线.,标准曲线与样品测定结果（实物实拍）,测定样本： 病人血清（ 标本 1. 25mm， 标本 2. 20mm ）,标准曲线制备：标准抗原稀释4钟浓度，预温24h，沉淀环直径数据 30 m m 25 m m 20 m m 15 m m,以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。,沉 淀 环 直 径（毫米）,4,2,5,6,7,3,8,标准抗原稀释：
5、1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160相当抗原浓度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L沉淀环直径： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mmLg值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796,0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0,9,【实验方法】1. 制备1.0%免疫盐水琼脂液取琼脂粉1.0g ，加入100ml. NS，混匀加热溶解。加热时用玻棒不断轻轻搅拌，使成透明液体，放56，加入 1 : 2 稀释的羊（兔）抗人血清1.25ml，混匀，56保温备用。2. 制板： 每2人制作1个凝胶板。取清洁玻片一张，在背
6、面一角处标记，用5ml或10ml刻度吸管 ，每片缓慢滴加3.5 - 4.0ml琼脂液，待凝。3. 打孔： 每玻片打孔两个，孔径3mm，孔距1.0-1.2cm，用竹签尖将孔内琼脂挑出。4. 加样： 用NS将血清稀释）10l血清+190l,NS= 1:20 混匀3次，吸出10l + 10l NS= 1;40向琼脂孔内分别加入:20， 1 : 40 稀释血清各10l 5. 保温反应：将琼脂板放湿盒内，37温育24-48h。6. 测量沉淀环最大直径，查标准曲线。计算：血清 IgG (mg/L) =对应的血清IgG含量（稀释倍数）,以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线
7、，根据样本测得直径，查出结果。,沉 淀 环 直 径（毫米）,4,2,5,6,7,3,8,标准抗原稀释： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160相当抗原浓度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L沉淀环直径： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mmLg值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796,0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0,9,Ag,Ag,Ag,Ag,【结果计算】 分别量取各孔样品沉淀环的直径，在标准曲线上查出对应的IgG含量。 待测血清IgG含量(mg/L)IgG mg/L = 标准曲线对应结果4（稀释倍数） 参考值:成人血清 IgG: 700-1660mg/L(0.7-1.6g/L),实验报告1. 简述单向扩散试验测定IgG的实验原理2. 根据老师提供数据绘制标准曲线3. 根据检测结果，数据，在标准曲线上查出相应结果，报告计算公式与测定结果,
