1、Protein,第1章 蛋白质的化学,蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动最基本的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。如，生物专有的催化剂酶一个细胞中约含有104种蛋白质，分子的数量达1011个。,原生质中各种物质的平均值,一、蛋白质通论,（一）、蛋白质的化学组成和分类,、元素组成,、蛋白质的含氮量,蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。 大多数蛋白质含氮量接近于16%蛋白质含量 = 每克样品中含氮的克数6.25 凯氏定氮法,奶粉-三聚氰胺事件,三聚氰胺其分子中含有大量氮元素。用普通的全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质数值时，根本不会区分这种
2、伪蛋白氮。添加在食品中，可以提高检测时食品中蛋白质检测数值。目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3克/公斤体重。据1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。 由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人称为“蛋白精”。,蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子式含氮量为66左右。通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估
3、算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现。“有厂商承认饲料里添加微毒三聚氰胺在中国习以为常，在动物饲料中添加三聚氰胺，将提高饲料的氮含量，让人误以为该饲料的蛋白质比较丰富，其营养价值实际上却没有增加。猪、鸡、鱼饲料与宠物食品的制造商因此趋之若鹜。”,(Amino Acid, AA, Aa, aa),氨基酸,蛋白质的构件分子,Protein Architecture,一
4、、氨基酸,（一） 蛋白质水解,蛋白质和多肽的肽键可被催化水解 酸/碱能将蛋白完全水解酶水解一般是部分水解,得到各种AA的混合物,得到多肽片段和AA的混合物,氨基酸是蛋白质的基本结构单元,蛋白质月示胨多肽肽AA1*104 5*103 2*103 1000 200 100-500,（二） 氨基酸的结构,地球上天然形成的AA200种以上。 构成蛋白质的AA只有20余种，且基本是-氨基酸。,什么是氨基酸？,氨基酸是指含有氨基的羧酸。蛋白质是由20种氨基酸组成的，除脯氨酸外，均为-氨基酸。即羧酸分子中-碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。,-C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-
5、COOH -氨基酸 -C-C-C(NH2)-C-COOH -氨基酸 -C-C(NH2)-C-C-COOH -氨基酸,什么是-氨基酸？,（三）氨基酸的分类,天然氨基酸的分类 蛋白质氨基酸 常见氨基酸（基本氨基酸）：参与蛋白质组成的只有二十种左右。 不常见的氨基酸：它们都是在已合成的肽链上由常见的氨基酸经专一酶催化修饰转化而来的。 非蛋白质氨基酸,1、常见氨基酸的分类 （1）按R基的化学结构分类： 脂肪族氨基酸 芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、(色氨酸)。 杂环氨基酸：组氨酸(碱性)、色氨酸。 杂环亚氨基酸：脯氨酸。 （2）按R基的极性分类：,按基的化学结构分类：,、脂肪族aa,（）中性aa,（2
6、）含羟基或硫aa,胱氨酸,（）酸性aa及其酰胺,（）碱性aa,、芳香族aa,、杂环aa,按基的极性性质分类：,、非极性基aa,、不带电荷的极性基aa,3、带正电荷的基aa-碱性aa,4、带负电荷的基aa酸性aa,2 不常见的蛋白质氨基酸,由常见aa经修饰而来。,3 非蛋白质氨基酸,150多种 多是蛋白质中L型-AA衍生物 有一些是-，-，-AA 有些是D-型AA,鸟氨酸瓜氨酸,二 氨基酸的溶解度、旋光性、光吸收 1、溶解度 2、氨基酸的旋光性 甘氨酸除外，无手性碳原子。,说明：苏氨酸，异亮氨酸，羟脯氨酸，羟赖氨酸，有二个不对称碳原子。苏氨酸的四个异构体如下：, 胱氨酸光学异构体的特殊性。,外消
7、旋体：一对对映体右旋体和左旋体的等量混合物。旋光方向相反、旋光能力相同的分子等量混合而成，其旋光性因这些分子间的作用而相互抵消，因而是不旋光的。 内消旋体：分子内，含有构造相同的手性碳原子，但存在对称面的分子。分子内虽然含有两个不对称碳原子C*，但由于它们具有对称因素，一半分子的右旋作用被另一半分子的左旋作用在内部所抵消，因此是一个不旋光性化合物 。, 氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基的性质，溶液的pH有关，测定的溶剂有关。,3、氨基酸的吸光性在近紫外光区域（220300nm）只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的最大光吸收波长（max）在275nm，275=1400；苯丙氨
8、酸的max在275nm，275=200；色氨酸的max在280nm, 280 =5600。利用分光光度法很方便地测定蛋白质的含量。,三、氨基酸的酸碱性质,（一）兼性离子,（二）氨基酸的解离,（三）氨基酸的等电点,当溶液为某一pH值时，AA的氨基和羧基的解离度完全相等，正负离子浓度相等。AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一pH值即为AA的等电点（pI）。 在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。 在pI时，AA的溶解度最小.,侧链不含离解基团的中性AA pI = (pK1 + pK2 )/2,甘氨酸滴定曲线,对于侧链含有可解离基
9、团的AA pI取决于两性离子两边pK值的算术平均值 酸性AA：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性AA：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,四、氨基酸的化学反应,（一）-氨基参加的反应,（二） -羧基参加的反应,（一）-氨基参加的反应,1.与亚硝酸反应,2.与酰化试剂反应,3.烃基化反应,4.形成Schiffs碱反应,5.脱氨基反应,NH2 OHR CH COOH + HNO2 R CH COOH+H2O+N2Van Slyke 法测氨基氮（体积）的基础。 N2中的1/2为氨基氮。,氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。,弱碱性,DNP-氨基酸 （黄色）,DNFP,S
10、anger 法测定N末端氨基酸基础,在生物体内经AA氧化酶催化 即脱去-氨基而转变为酮酸。,（二） -羧基参加的反应,1.成盐或成酯反应,2.成酰氯反应,3.脱羧基反应,4.叠氮反应,（2）成酯 NH2 干燥，HCl R CH COOH + C2H5OH 回流 R CH COOC2H5 + H2O,NH3Cl,保护羧基,（1）与NaOH等形成盐,HN-保护基 R CH-COOH + PCl5 HN-保护基R CH-COOCl + POCl3 + HCl,保护氨基 活化羧基,NH2 脱羧酶RCH-COOH R-CH2-NH2 +CO2,（三）-羧基和-氨基都参加的反应,1、 与茚三酮反应,2、
11、成肽反应,弱酸 加热,六、氨基酸混合物的分析分离,层析系统,固定相,流动相,附着在固相上的液体,固体,薄层层析,分配柱层析装置,填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮显色定量。,（二 ）离子交换层析,固定相支持剂颗粒细，表面积大； 采取高压，洗脱速度快,高灵敏度的检测器。,（六）高效液相层析,氨基酸的制备,目前氨基酸的生产方法分三类： （1）直接发酵法； （2）化学合成法； （3）蛋白质水解提取法（酸、碱、酶）。,八、氨基酸的应用,1、医药工业 （1）氨基酸输液 （2）必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸 （3）半必需氨基酸
12、：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。,治疗药剂,（1）精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果； （2）天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。 （3）半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等； （4）组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。,2、化学工业,（1）维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。 （2）叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。 （3）氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-赖氨酰-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。 （4）聚合
13、氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。,3、食品工业,营养强化剂； 谷氨酸钠味精； 天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口； 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APM,4，农业,（1）杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果； （2）杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等； （3）除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；,5、化妆品工业,氨基
14、酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。,四、肽（peptide）,AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键 称肽键，所形成的化合物称肽。,由两个AA组成的肽称为二肽。 由多个AA组成的肽则称为多肽（肽链）。 组成多肽的AA单元由于参加肽键的形成已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基。,游离的末端氨基 游离的末端羧基,两个游离的末端基团有时连接而成环状肽键。,肽的物理化
15、学性质,肽末端-羧基pKa值比游离AA中的大。肽末端-氨基pKa值比游离AA中的小。等电点（两性）。酸碱性质取决于：-羧基、-氨基、侧链基团的解离具有双缩脲反应肽、Pr特有的反应。,碱性CuSO4,（三）、 天然存在的重要多肽,谷胱甘肽是存在于动植物和微生物细胞中的一个重要的三肽，简称GSH，是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的。,重要激素举例,（一）氨基酸衍生物激素,1、甲状腺激素,（1）结构,甲状腺素（3,5,3,5-四碘甲腺原氨酸，简称T4）。,三碘甲腺原氨酸（3,5,3-三碘甲腺原氨酸，简称T3）,（2）生物合成,二分子二碘Tyr作用形成甲状腺素（T4）,一碘Tyr,（3）生理功能, 促
16、进体内各物质的代谢，增加代谢率；另外增加耗 氧量和产热量。, 维持机体的正常生长发育。,甲亢 大脖子病,2肾上腺素,肾上腺素可使血管收缩；并能刺激心脏，使心肌收缩力增加，心跳加快，所以使血压升高。（对心脏 作用大） （临床上被用来作为升压药物，起抗休克作用）,狗急跳墙：血流速度快，血氧、血糖高,生物合成,Tyr,羟化,CO2,羟化,正肾上腺素（去甲肾上腺素）,+ CH3（由Met供给）,肾上腺素,Tyr羟化酶,重要多肽类激素,这类激素包括由垂体（腺垂体、神经垂体），下丘脑、胰腺、甲状腺、甲状旁腺、胃肠和胸腺等分泌的激素。,1腺垂体激素：,生长激素（GH） 促甲状腺素（TSH) 促黄体生成素（L
17、H） 促卵泡素（FSH） 催乳素（LTH） 促肾上腺皮质素（ACTH） 促黑素（MSH） 内啡肽, 生长激素 （GH）,化学本质：蛋白质,（1）：促进蛋白质和RNA的生成 （2）：调节糖和脂肪代谢 （3）：刺激软骨的生长（最主要）过多：幼体巨人症成人肢端肥大 缺乏：侏儒,功能：,催乳激素（LTH）：,催乳激素中有一段氨基酸序列与生长激素相似,一条肽链的蛋白质，人的LTH约由200个氨基酸组成。,功能：刺激乳腺分泌乳汁，刺激黄体分泌孕酮。,化学本质：都是糖蛋白,促甲状腺素（TSH）,促卵泡激素（FSH）,促黄体生成素（LH）,促激素、促性腺激素,促激素,促甲状腺激素：靶腺是甲状腺，促使甲状腺发育
18、以及分泌甲状腺激素，从而影响全身代谢。,功能：, 促肾上腺皮质激素（ACTH）,ACTH是39个氨基酸组成的多肽，有种属差异。,生理功能： 促使肾上腺皮质发育和促使肾上腺皮质分泌激素。,促黑素,促进皮色素形成和控制皮色素颗粒在细胞质内的分布,内啡肽,吗啡功能：镇痛,结构：,催产素（oxytocin）和升压素（也称加压素vasopressin）是含S-S键的9肽。,这两种激素肽链骨架相似，都为含二硫键的二十元环，差别在第3位和第8位氨基酸不相同。,2、神经垂体激素,催产素：使子宫平滑肌收缩，用于催产，还可使乳腺平滑肌收缩，排出乳汁。,功能：,升压素：使毛细血管收缩，增加血压；并有减少排尿的作用，
19、即抗利尿作用，所以升压素也称抗利尿激素。,胰岛素（insulin）,功能：, 促进糖原的生物合成以及葡萄糖的氧化，降低血糖。, 促进蛋白质及脂类的合成代谢。,（2）胰高血糖素（glucagon）,结构：29肽,功能：在许多方面与胰岛素相反。, 主要促使肝糖原分解，使血糖, 促使脂肪分解。,甲状旁腺激素和降钙素,甲状旁腺激素（PTH）,结构：蛋白质激素，有种属差异。,降钙素（CT）,结构：由32个氨基酸组成的多肽,甲状旁腺激素：血钙，血磷。,降血钙素：血钙，血磷。,1,25-二羟胆钙化醇：血钙，血磷。,其他激素,7.胃肠激素 8.绒毛膜促性腺激素：验孕 9.松弛素：分娩 10.胸腺素：T cel
20、l 11.白介素：T cell 12.调钙素 13.生长因子：表皮、神经,五、蛋白质的结构 一级结构：多肽链共价主链的氨基酸顺序。 二级结构：多肽链借助氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象，如纤维蛋白质中的-螺旋和-折叠片。 三级结构：多肽链借助各种次级键（非共价键）盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。 四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系或结合方式。寡聚蛋白质中各个亚基又有自己特定的三维构象。,蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目. 多肽链的氨基酸顺序， 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多
21、肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,一、蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,1.样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量,前提,（一）、蛋白质测序的策略 1 .确定蛋白质的纯度在97%以上（艰难的工作）。 2 .测定多肽链的数目（N-、C-）。 3 .拆分多肽链（包括-S-S-键）。 4 .分析每一条多肽链的氨基酸组成（种类、数量）。 5.鉴定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基。 6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。 7.测定各肽段的氨基酸序列。 8 .拼接各肽段成完整的多肽链。 9.确定二硫键的位置。,牛胰岛素一级结构,牛胰岛素的分子量为道尔顿，分子中含有两条多肽链，一条称链（含个残基）另一条称链（含个残基），三对二硫键，两对链间，一对链内。,
