1、器材准备,浓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球 1瓶，眼科镊子2把；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板5个。,自然界中的微生物,已经发现的微生物大约13万5千多种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。这些微生物存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹 。 空气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。 存在于人体消化道的细菌超过800种，数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5公斤。,医学微生物学实验 综合性实验三 Comprehensive Exper
2、iment 3,空气与人体体表细菌学检查 空气的细菌学检查P38 手指皮肤的细菌学检查P41,空气的细菌学检查P38,空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。 环境：不利于微生物生长。 种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌的数量比较多。 作用：可迅速全球传播。 危害：引起培养基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道传染病。,实验方法：自然沉降法是根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面；培养以后，计数菌落形成单
3、位（ colony forming unit ，CFU），了解空气的污染情况。实验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、宿舍、卫生间、饭堂或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁，平板暴露于空气中15分钟，然后盖上盖子，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。 CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。N：平板上的菌落数。 A：平板面积(平方厘米)。T：采样时间(分钟)。,手指皮肤的细菌学检查P41,在日常生活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净 ”的手，可携带10万个细菌、200多种病毒。因此，经手传播的疾病很多，范围很广，
4、包括肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手间接传播的疾病。 常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。 暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住菌。,医务人员，经常要与病人接触，不管是直接接触，还是间接接触，都有传播病菌的可能。虽然病菌的直接来源是患者, 但是造成病菌扩散的主要途径则是气溶胶和医务人员的手。因此，经常洗手和消毒是控制医院内交叉感染的主要方法。 实际上，预防感染措施中，最简单又十分有效的方法就是洗手。据测定，只用自来水洗手可使暂住菌总
5、数减少40%，用肥皂洗手可减少80%以上。 洗手？,常规的洗手方法（甲和丙操作）,将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。 反复搓揉双手，搓揉时间不应少于 30秒。 用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除大多数手上的暂住菌。,医学微生物学实验室标准洗手方法（乙和丁操作）,用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。分别搓擦1015次。 保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。,1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦,4.两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦,1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对
6、掌心搓擦,4.两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦,医务人员洗手指征,接触传染病患者之后。 接触携带多耐药性细菌的病人之后。 接触病人的血液、体液、分泌物和排泄物之后。 接触高危病室两个病人之间、新生儿室两个新生儿之间 接触旧钱币之后。 上厕所前后。 进行微生物操作或作血、尿等生化、免疫测定之后。 在施行各种手术前后。 诊断、治疗、护理特别易感染的病人之前。 进食之前。,手指皮肤的细菌学检查,第1格为洗手前， 第2格为洗手后， 第3格为消毒后， 第4格空白对照。,2人1个营养琼脂平板,上:甲、丙常规洗手 下:乙、丁标准洗手,甲（丙）,乙（丁）,丙,丁,医学微生物学实验
7、 综合性实验一(P2),脓汁和粪便标本中病原菌的检测(二） 临床标本的检查程序 细菌的分离与培养P7目的要求：掌握分离、纯化微生物的基本操作技术。,常见病原性球菌的检查程序P47：直接涂片、革兰染色、镜检 脓汁、痰、咽部分泌物 观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板培养 涂片染色镜检挑取可疑菌落 生化反应 纯培养 动物实验药敏实验 血液、穿刺液 肉汤增菌培养 培养液涂片染色境检 常见肠道致病菌的检查程序P48：粪便 SS琼脂、伊红美蓝平板培养 挑取可疑菌落 血清学鉴定 血、骨髓 增菌培养 双糖铁培养基 染色镜检 生化反应,平板划线分离法 Streak Plate Method,借助于划线，将混杂
8、的多种细菌，在固体培养基表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团。 在固体培养基表面或基内，由单个细菌在局部位置不断增值的稠密群体称为单菌落。 在固体培养基表面，由多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物,称为菌苔。,平板分区划线分离法步骤（5区） 接种环烧灼灭菌，以免污染标本。 取标本在平板表面上方密集涂布510mm2。 烧掉接种环上多余的标本（火焰背面烤干烧灼）。 晃动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。 接种环与平板呈3040度角，通过密集涂布部分13次，使接种环重新沾上少量标本(细菌)，然后
9、在平板表面，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。 转动平板，接种环通过第一区1次，同样的方法划第二区。如此依次划完35区。 接种环烧灼灭菌，以免污染环境。 将平板倒置37培养1824h 。充分利用平板面积，不能划破琼脂。,第四区,平板划线分离小组分工,甲脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate) 乙脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate）丙粪便标本伊红美蓝平板(eosin methylene blue plate） 丁粪便标本伊红美蓝平板(EMB plate）,实验分组,俩俩相对4人为一个小组,组号编
10、在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙4 丙 丁,甲 乙3 丙 丁,甲 乙2 丙 丁,甲 乙1 丙 丁,甲 乙5 丙 丁,甲 乙8 丙 丁,甲 乙7 丙 丁,甲 乙6 丙 丁,甲 乙10 丙 丁,甲 乙9 丙 丁,讲台,杆1214cm,环直径24mm,柄10cm,接种环 inoculating loop,杆1214cm,柄10cm,针46cm,接种针 straight wireinoculating wire ,inoculating needle,接种环烧灼灭菌 Flame Loop,使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可。 使用后，
11、先在火焰背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。 金属杆快速通过火焰23次，杀灭表面微生物。,酒精灯无菌操作区,外焰:又称氧化焰,火焰呈淡紫色,温度较高。,无菌操作区:火焰周围1020cm范围内。,环面水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。,环面垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。,接种环取液体标本的方法：,环直径3mm,无菌取材基本步骤,接种环、平板的握持方法,接种环、平板的握持方法,正确 correct,错误 incorrect,平板划线示意图,涂布 spreading,细菌大多分散成单个。,细菌前段很多，后段太少，分离效果差。,510mm2,30条线/区,平
12、板划线不少于150条线,37培养24小时,37培养24小时,生物安全警告,接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,思考题,为何取链球菌作为空气的卫生指标之一? 为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌? 为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害? 做细菌培养时，平板为什么要倒置
13、? 培养细菌的常用方法有哪些? 从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项?,实验内容,空气的细菌学检查P38 营养琼脂平板(黄色,1组1个） 手指皮肤的细菌学检查P41 营养琼脂平板(黄色,2人1个 划分8格） 平板划线分离法P8 甲脓汁标本营养琼脂平板(黄色） 乙脓汁标本营养琼脂平板(黄色） 丙粪便标本伊红美蓝平板(紫色） 丁粪便标本伊红美蓝平板(紫色）,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1和第2列分别放置接种针 和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验器材 整齐有序,微生物学器材柜-2（边台东侧中段）,酒精棉球,碘酒棉球,镊子,电炉、石棉网,手套,消毒器材收拾入柜 依次摆整齐 ,
