1、第八章,发酵工业的无菌技术,本章内容,一、概念 二、发酵工业的无菌技术 三、培养基及设备灭菌 四、空气除菌,一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐,灭菌:用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒:用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌:用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐:用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。 消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用,二、发酵工业的无菌技术灭菌方法,干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法,三、培养基及设备灭菌,（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌）
2、（三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较,1. 热阻 2.灭菌温度和时间的选择 3. 影响培养基灭菌的其它因素,（一）湿热灭菌原理,1. 热阻,定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数k来表示 。k，热阻, t,当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。 当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- E/RT) k与微生物活化能及T有关,1. 热阻,大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,2. 灭菌温度和时间的选择,培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中C：对热不稳定物
3、质的浓度；k：分解速度常数；k的变化也遵循阿累尼乌斯方程：,都与相应的活化能及T有关,当T1 T2(k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE)随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。,2. 灭菌温度和时间的选择,3. 影响培养基灭菌的其它因素,培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。,pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其
4、死亡。培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。 培养基的物理状态 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量,3. 影响培养基灭菌的其它因素,分空气过滤器灭菌 并用空气吹干,夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽,达70左右,取样管,放料管,通蒸汽,120，1105pa,保温,保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定,罐压接近空气压力,向罐内通无菌空气,保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门,夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度,（二）分批灭菌（实罐灭菌） 1.灭菌工艺过程,升
5、温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式(N/N0) =-kt来粗略估算灭菌所需时间。,2. 灭菌时间的估算,2. 灭菌时间的估算,例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。解：N0=401062105=81012(个)Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min)由
6、于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。,（三）连续灭菌（连消）,工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算(Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct)式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数。,例2某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。,连续灭菌时间的估算,解：C0=2105(个/ml)Ct=0.001/(4
7、0106)=2.510-11(个/ml)t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37 min,喷淋冷却连续灭菌流程,分批灭菌与连续灭菌的比较,连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。,缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭
8、菌不彻底。,分批灭菌与连续灭菌的比较,四、空气除菌,（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气过滤介质,（一）概述,空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。,空气除菌方法 辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、射线、射线、紫外线(2265 3287 ) 加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量 静电除菌 ：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一
9、次除尘，配合高效过滤器使用。 过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。,（一）概述,1. 对空气过滤除菌流程的要求,流程主要设备：空气压缩机 、空气过滤器 附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器,流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑 环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件； 在温暖潮湿的南方，要加强除水设施 ； 压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染 ，也可采用无油润滑的往复式压缩机； 往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。 通常
10、要求压缩空气的相对湿度=50%60%时通过过滤器为好。,1. 对空气过滤除菌流程的要求,2. 空气除菌流程的分析,空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、 过滤 几种典型的设备流程 两级冷却、加热除菌流程 冷热空气直接混合式空气除菌流程 高效前置过滤空气除菌流程 将空气冷却至露点以上的流程 利用热空气加热冷空气流程 一次冷却和析水的空气过滤流程,（三）空气预处理,1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐2. 预处理流程
11、设计的简繁关键：去湿问题,措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、,填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器,两级冷却、加热除菌流程图 1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器； 8-加热器；9-过滤器,冷热空气直接混合式空气除菌流程图 1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器,利用热空气加热冷空气的流程示意图 1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-空气分过滤器,将空气冷却至露点以上的流程 1高空采风；2粗过滤器；3压缩机；4冷却器；5冷却器；6空气总过滤器；7空气分过滤器,高效前置过滤空气除菌流程图 1高效前置过滤器；2压缩机；3贮罐；4冷却器；5丝网分离器；6加热器；7过滤器,一次冷却和析水的空气过滤流程示意图 1高空采风；2粗过滤器；3压缩机；4冷却器；5，6析水器；7贮罐；8加热器；9空气总过滤器；10空气分过滤器,空气预处理流程设计,（四）空气过滤介质,棉花 玻璃纤维 活性炭 超细玻璃纤维纸 石棉滤板 烧结材料过滤介质 新型过滤介质,本章小结,掌握有关无菌技术的基本概念 掌握培养基及设备灭菌的基本原理、基本方法及灭菌时间的估算 掌握空气除菌基本原理、流程及空气预处理设计,
