1、液相色谱柱的选择和方法开发,奥秘科技/AUMI Technologies （US）,内容概要,色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发,色谱基本概念回顾,色谱（chromatography）,色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）,分离度,Rs - ResolutionN Theoretical Plate Number Selectivityk Retention Factor 拖尾,1.Separat
2、ion of Compounds A and B,灵敏度,：Limit of Detection ：Limit of Quantification 柱效峰形（拖尾因子）,重现性,分离度（） 保留时间（，）选择性（ ）柱效 （） 灵敏度,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响,分离度 - 选择性 键合类型，基质表面特性；流动相、温度- 柱效 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速 峰对称性 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 灵敏度 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度
3、 稳定性和重现性 基质表面特性，键合类型；流动相，温度流动相 pH，缓冲盐种类，溶剂；,影响色谱柱性能的主要因素,1、 色谱柱的构型色谱柱内径色谱柱长度2、 固定相柱填料粒径比表面积孔径孔隙率基质表面特性：- 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量- 耐碱性键合类型- 官能团、是否封尾- 键合相的保留行为、耐酸性,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) 满足检测器和样品量限制 宽径柱
4、 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命制备柱 (内径 10 mm) 用于纯化制备,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0m，3.5m 普通快速分析5.0m 常规分析,颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表
5、面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II,由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件： C8色谱柱，4.6150mm， 3.5um， A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈 水中； 20min梯度，10 3
6、0%B；60C， 1.5ml/min,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=？,流动相： 甲醇：水=65：35 流速： 1 mL/min 温度： 35
7、 检测波长： 230 nm 进样量： 20 L,硅胶纯度金属含量,硅胶基质类型及发展史,Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗 杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响,残余硅羟基的影响 普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。 解决方法 封尾 双层表面修饰 表面杂化,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾 键合填料与小硅烷进
8、行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。 缺点： 不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应） 在pH3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰 降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟基pH=5.2， 普通硅羟基pH约为3.5 更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖 重现性更好表面纯度
9、更高硅胶金属杂质被覆盖 极性化合物保留和分离更好,键性化合物峰形对比,Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm,Brand A C18( non-endcapped, ),C18 (n
10、on-endcapped, twin-layer,ASB C18,Zorbax SB C18,Saponins Extract,4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰代表产品： StableBond C18，PolarBond C18，SurfBond C18,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,AUMI Baulo StableBond C18, 2.150mm, 5m,Brand A C18 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.0
11、50mm, 5m,固定相对色谱柱性能的影响：键合类型,A 纵向交联：保留和选择不稳定 B 横向交联：宽pH适用 C 单体键合：重现性好，柱效高 D 单体（空间保护）：低pH稳定 极性官能团嵌合反相固定相,固定相对色谱柱性能的影响： 基质表面特性+键合类型 反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱：保留值随含碳量的增加而增加比表面积越大，保留值越大键合碳链越长，保留越大 C18 C8C3C1，长链之间差别不大,反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，,拖
12、尾峰,T0（尿嘧啶）,P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯,固定相对色谱柱性能的影响： 基质表面特性+键合类型 键合相的稳定性,键合相的稳定性低pH值，键合相流失高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现,键合类型对键合相稳定性影响,低pH值，键合相流失,键合类型对键合相稳定性影响（II）,空间位阻保护，延缓键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,高pH值，硅胶基质溶解,pH9时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高pH值水解,杂化颗粒： Waters Xterra,表面碳杂化示意图,
13、pH=12 条件下的稳定性,4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um,1h,200 h,总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件,了解目标化合物的性质：结构（官能团）、pKa、分子量、浓度范围、溶解度、极性 了解色谱柱的性质 粒径，孔径，比表面积 保留强度和柱效；抗污染性 基质表面特性，键合类型保留强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性 选择相应的色谱条件,色谱柱选择 （）,替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似 新方法开发： 粒径：2um vs 3um vs 5um （分析时间，灵敏
14、度，仪器，价格，寿命） 内径柱长：内径3mm vs 4.6 vs 7.8（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相关 比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分离） 孔径： 在满足比表面前提下大孔径较好 硅胶基质表面特性：）尽可能使用高纯硅胶；）尽可能使用低酸性硅胶；）当流动相尽可能使用表面杂化；）使用多硅羟基残留，可加强对于极性化合物保留或削弱对于非极性化合物保留 键合类型：取决于选择性和流动相要求；具有一定极性的（）可以作为首选尝试；耐酸：选择；耐碱：Durashell 封尾与不封尾：封尾削弱硅羟基影响；不封尾：提高硅羟基影响，增强极性物质保留，降低柱流失。,乙腈水,乙腈水,乙腈水,KH2PO4 pH=4.2,
