1、第三章 消毒灭菌与病原微生物实验室生物安全,第四章 噬菌体,Chapter 3 Disinfection, Sterilization and Biosafety of Pathogenic Microbiology Lab 第三章 消毒灭菌与病原微生物实验室生物安全,Section 1 Conmmon Terminology of Disinfection and Sterilization 第一节 消毒灭菌常用术语,消毒(disinfection) ： The reduction or elimination of pathogenic microorganisms in or on ma
2、terials, so they are no longer a health hazard.杀死物体上病原微生物的方法,称为消毒。(不一定能杀死含芽胞的细菌和非病原微生物),灭菌(sterilization) ：The process of destroying all microbial forms. A sterile object is free of all microbial forms, including bacterial spores. 杀灭物体上所有微生物的方法。(包括杀灭病原微生物和非病原微生物、细菌的繁殖体和芽胞)要求比消毒高。,概念：,概念：,防腐(antiseps
3、is) ：,Use of chemical agents on skin or other living tissue to inhibit or eliminate microbes; no sporicidal杀芽胞的 action is implied. 防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。,无菌(asepsis) ：No living microorganisms exists. 无菌操作(antiseptic technique)：防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。,清洁(cleaning)：通过除去尘埃和一切污秽以减少微生物数量的过程。,Section 2 Met
4、hod for Controlling Microorganisms 第二节 消毒灭菌的方法物理消毒灭菌法Controlling microorganisms by physical agents 化学消毒灭菌法Using Disinfectants and Antiseptics to Control Microorganisms,一.物理消毒灭菌法Controlling microorganisms by physical agents 主要有:热力、辐射、滤过、干燥与低温等。(一)热力灭菌法 High Temperature无芽胞细菌经55-60作用30-60分钟死亡;湿热80经5-6分
5、钟可杀灭所有细菌繁殖体、真菌和酵母菌。干热灭菌法 Dry heat湿热灭菌法 Moist heat,1.干热灭菌法dry heat sterilization A.原理:脱水干燥和大分子变性。 B.方法: 焚烧：废弃物、尸体; 烧灼:接种环和试管口的灭菌; 干烤:烤箱灭菌; 171,1h; 160,2h; 121,16h 适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品,例玻璃器皿、瓷器、玻璃注射器等的灭菌。 红外线：0.7-1000m电磁波，1-10 m热效应强；照射表面灭菌，不能使物体均匀加热，医疗器械灭菌,2.湿热灭菌法moist heat sterilization A巴氏消毒法(pasteu
6、rization)：法国巴斯德创用61.1-62.8，30分钟；71.715-30秒 主要用于牛乳消毒。 B.煮沸法: 2%碳酸氢钠 食具、刀剪、镊子等 C.流动蒸气灭菌法:又称常压蒸气灭菌法 D.间歇蒸气灭菌法:Arnold(阿诺氏灭菌器)此法用于不耐高热的含糖、牛奶等培养基的消毒。 E.高压蒸气灭菌法（autoclaving）:最有效的一种灭菌方法1.05kg/cm2(15磅) 、121.3，15-20分钟。用于一般培养基、生理盐水、手术敷料等耐高温耐湿等物品的灭菌。,高压蒸汽灭菌器,湿热灭菌的效力比干热灭菌的大,原因: 湿热中细菌菌体蛋白较易凝固; 穿透力比干热大; 湿热的蒸气有潜热存在
7、。,（二）辐射杀菌法Radiation sterilization,1.紫外线 Ultraviolet ray波长240-300nm的紫外线具有杀菌作用。 265-266nm其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。 应用：手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒，或不耐热物品的表面消毒。 2.电离辐射射线、射线 一次性医用塑料制品、药品等的灭菌 3.微波波长1mm1m 食品、非金属器械、检验室等用品消毒,（三） 滤过除菌法 Filtration sterilization,1.滤菌器 薄膜滤菌器硝基纤维素膜玻璃滤菌器石棉滤菌器素陶瓷滤菌器
8、主要用于不耐高温的血清、毒素和抗生素等2.空气除菌采用生物洁净技术,滤器和层流室,（四） 干燥与低温抑菌法 dry and low temperature bacteriostasis,干燥法低温法：低温可使细菌的新陈代谢减慢，常用作保存细菌菌种。冷冻真空干燥法lyophilization是目前保存菌种的最好方法。,常用消毒剂的杀菌机制sterilizing mechanism of chemical disinfectants 1、使菌体蛋白变性或凝固：例酚类(高浓度)醇类等；2、干扰微生物酶系统和影响其代谢:例重金属与细菌的-SH基结合使有关酶失去活性；3、损伤细胞膜：例表面活性剂和脂溶剂
9、（新洁尔灭等）。选择原则效果好（适时适量适度）、毒力低、便宜,二、化学消毒灭菌法Using Disinfectants and Antiseptics to Control Microorganisms,（一）高效消毒剂（high-level disinfectants）杀芽胞1.含氯消毒剂；2.过氧化物消毒剂；3.醛类消毒剂；4.环氧乙烷 （二）中效消毒剂（intermediate-level disinfectants）杀繁殖体1.含碘消毒剂；2.醇类消毒剂 （三）低效消毒剂（low-level disinfectants）杀多数繁殖体1.季铵盐类；2.氯已定；3.高锰酸钾,化学消毒剂 按
10、其杀菌能力可分为三大类：,第三节 消毒灭菌的运用,（一）医疗器械物品的消毒灭菌1、高危器械物品 用时需进入无菌组织的物品。所有这些物 品都应该灭菌。 2、中危器械物品 用时不进入无菌组织，但接触黏膜的器械。 采用消毒即可。3、低危器械物品 只接触未损伤皮肤，但不进入无菌组织和不接触黏膜的物品。一般用后清洗、消毒即可。4、快速周转的医疗器械,(二)室内空气消毒灭菌 1、物理消毒法 紫外线照射（1.5W/m3，1h）最常用； 滤过除菌：空气通过孔径小于0.2m的高效过滤装置以除去细菌和带菌尘埃 2、化学消毒法 包括化学消毒剂喷雾和熏蒸： 过氧乙酸喷雾、熏蒸； 过氧化氢喷雾； 二氧化氯溶液喷洒； 中
11、草药点燃烟熏。艾叶,（三）手和皮肤的消毒用肥皂和流动水经常并正确洗手；病原微生物污染时应用消毒剂消毒。,（四）黏膜的消毒 （五）病人排泄物与分泌物的消毒灭菌 （六）病人污染物品的消毒 （七）饮水的消毒 （八）环境的消毒,Section 4 Factors influencing antimicrobial activity 第四节 影响消毒灭菌效果的因素,一、微生物的种类 真菌、细菌繁殖体、病毒、芽胞 二、微生物的物理状态 三、微生物的数量 四、消毒剂性质、浓度与作用时间 如表面活性剂 G+ 五、温度 一般温度升高可提高消毒效果 六、酸碱度 戊二醛+碳酸氢钠 七、有机物,第五节 病原微生物实验
12、室生物安全,生物安全（biosafety）是生物技术安全（safety of biotechnology）的简称。 狭义：现代生物技术的研究、开发、应用及转基因生物可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的危害。 广义：与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康及生态环境所产生的危害或潜在风险。,病原微生物所致的安全问题，如病原微生物实验室的 安全隐患、生物武器、生物恐怖、重大传染病的暴发流行 等，也是人类社会所面临的最现实的生物安全问题。病原微生物实验室生物安全的核心是防扩散和防感染。关于病原微生物实验室生物安全，我国法令包括对病 原微生物的分类管理，对实验室的分级管理，实验室感染 的控
13、制以及监督和法律责任等。,一、病原微生物的分类,根据传染性、感染后对个体或者群体的危害程度， 病原微生物分为四类：,第二类：能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。包括高致病性禽流感病毒、艾滋病毒、狂犬病病毒、SARS冠状病毒等70种。,第一类：能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。包括天花病毒、埃博拉病毒等29种病原体。,第三类：能够引起人或动物疾病，但一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效 治疗和预防措施的微生物。包括：各型肝炎病
14、毒、疱疹病毒、流行性感冒病毒、破伤风梭菌等275种。第四类：在通常情况下不会引起人或动物疾病的微生物。如小鼠白血病病毒等。第一类、第二类统称为高致病性病原微生物。,二、病原微生物实验室的分级,一、二级实验室不得从事高致病性 病原微生物实验活动。三、四级实验室才能从事高致病性病原微生物实验活动。,生物安全,Chapter 4 Bacteriophage, phage第四章 噬菌体,（1975年英国细菌学家Twort首先观察到葡萄球菌菌落周围有透明斑的现象。）,噬菌体,细菌细胞,噬菌斑,噬菌体,细菌细胞,Bacteriophage (phage) are obligate intracellula
15、r parasites that multiply inside bacteria by making use of some or all of the host biosynthetic machinery * Bacteriophage are viruses that infect bacteria.,噬菌体,是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等 微生物的病毒。 特点： 个体微小，可通过细菌滤器； 无细胞结构，主要由衣壳（蛋白质）和核酸组成； 只能在活的微生物细胞内复制增殖，专性胞内寄生。 分布极广。,Section 1 Biological Characteristics of Bac
16、teriophage 第一节 噬菌体的生物学性状,1.形态与结构Morphology and Structure噬菌体有三种 基本形态，即蝌蚪 形、微球形和细杆 形。大多数噬菌体 呈蝌蚪形，由头部 和尾部组成。,2.化学组成蛋白质：构成头部衣壳和尾部，保护核酸。核酸：DNA或RNA，多数DNA噬菌体的DNA为线状双链，多数RNA噬菌体的RNA为线状单链。,3.抗原性：具有抗原性。 4.抵抗力：对理化因素的抵抗力比一般细菌繁殖体强。,第二节 毒性噬菌体 Section 2 Lytic or Virulent Phages,分类： 依据噬菌体与宿主的关系，噬菌体分为两种类型： 毒性噬菌体（viru
17、lent phage） 、 温和噬菌体（temperate phage）,毒性噬菌体virulent phage：能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌，称毒性噬菌体。 The phage can replicate in the infected bacteria and produce many progenies, resulting in the lysis of the infected bacteria finally. 1）溶菌性周期lytic cycle：吸附，穿入，生物合成和装配，成熟，释放等步骤。其中从吸附至细菌溶解释放子代噬菌体，称为噬菌体的复制周期或
18、溶菌周期。,毒性噬菌体在宿主菌内以复制方式进行增殖，增殖过程可分为四个阶段：,毒性噬菌体的溶菌周期,毒性噬菌体的群体观察 液体培养基中：使菌液变澄清 固体培养基上：噬斑,第三节 温和噬菌体 Section 3 Temperate Phage,温和噬菌体（temperate phage）的定义：,噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但随细菌DNA的复制而复制，并随细菌的分裂而传代，称为温和噬菌体，也称为溶原性噬菌体（lysogenic phage）。 the phage DNA actually integrates into the host chromosome and is re
19、plicated along with the host chromosome and passed on to the daughter cells.,温和噬菌体的复制周期：溶原性周期、溶菌性周期,1）前噬菌体(prophage)：整合在细菌基因组中的噬菌体基因组。 2）溶原性细菌(lysogenic bacterium)：带有前噬菌体基因组的细菌。 The cell harboring a prophage is termed a lysogen.,前噬菌体,溶原性细菌,Integrated phage DNA into the bug chromosome.,3）溶原性(lysogeny
20、)：温和噬菌体所具有的能产生成熟噬菌体颗粒和裂解宿主菌的潜在能力。 4）溶原性转换（lysogenic conversion）：某些前噬菌体可导致细菌基因型和性状发生改变。例如白喉棒状杆菌产生白喉毒素的机理,5）温和噬菌体的三种存在状态( three states in the host cells) （1） 游离的具有感染性的噬菌体颗粒 episomal and infectious （2） 宿主胞质内类似质粒形式的噬菌体核酸 the nucleic acid of phage （3） 前噬菌体 prophage,6）溶原状态的激发activation of lysogenic state：
21、 由溶原期-溶菌期 Lysogenic state can be activated into lytic circle. 溶原状态通常十分稳定，能经历许多代，但在某些条件下可中断溶原状态而进入溶菌性周期。如：紫外线、X线，致癌剂、突变剂等。,紫外线、X线，致癌剂、突变剂等。,温和噬菌体有溶原性周期和溶菌性周期， 而毒性噬菌体只有一个溶菌性周期。,温和噬菌体的意义 Medical importance of temperate phage： 1）温和噬菌体可以使溶原性细菌的表型发生改变。白喉毒素，-棒状杆菌噬菌体；肉毒毒素：2）转导(transduction)：3）溶原性转换（lysogeni
22、c conversion）：,噬菌体的应用,细菌的鉴定与分型；分子生物学研究的重要工具；细菌感染的诊断与治疗。,邱财康、噬菌体与瑞金医院邱财康曾经是一名普通炼钢工人，在50年代末，他曾经成为当时多部影视作品的主角。而这一切，都是因为一次不幸的事故。 1958年，当时28岁的邱财康，是上钢三厂炼钢车间的一名司炉长。5月26日晚上，一场意外发生了。炼钢炉里高达1200度的铁水，猛然倾倒在地，造成当时在场的三名工作人员受伤，邱财康就是其中之一。伤员被立即送往当时的广慈医院，也就是现在的瑞金医院接受治疗。 邱财康的烧伤面积达89.3%，其中三度烧伤占23%（三度烧伤是指皮肤全层都已烧坏）。按照当时最高
23、的国际医学水平，烧伤面积如果超过50%，死亡率就达85%，如果面积超过75%，就很难生存。,当感觉到死神的脚步时，邱财康对医生们说：“医生同志，要想法子救活我，把我治好，我还要回去炼钢。”这番坚强的话语冲击着抢救小组成员的心，更坚定了他们用智慧和勇气与死神作一番较量的决心。医院发动了30多名医生分工查阅近10年来各国发表的烧伤医学文献，最后归纳成15条治疗措施。由于病人体液大量的渗出，按照常规补液已感不足，朱德安医生提出加压快速输液的建议被采纳，从而打破了以往根据国际灼伤医学权威伊文思文献记载的每天输液不超过1万毫升的规定。3天过去了，当人们正在庆幸邱财康等人安然地渡过了休克关时，一个可怕的情
24、形发生了：病人背部创面有了感染，厚厚的绿色脓液散发出恶臭。当时被请来会诊的华山医院副院长戴自英果断建议，做各种浓度不同的联合抗生素敏感试验。做了58种实验后，控制绿脓杆菌的有效药物多粘菌素B被选中采用了。,控制住了感染，接下来就需要为病人实施植皮手术，到哪里去取皮呢？傅培彬、董方中等权威专家伸出自己的胳膊,一位又一位年轻的外科医生也自愿报名，为病人献出自己的皮肤,医生们就这样义无反顾。6月21日，治疗进入了新的阶段。医生决定征求两名健康的输血者，要在他们身上注射3种细菌的混合菌苗。输血者发过高烧以后，血液里就会产生一种抗体，把带有抗体的血输给邱财康，便可以杀死他血液中的细菌，增加他身体的免疫力
25、。征求信息发布的当天，第二医学院和广慈护校的学生们便纷纷赶来报名。儿科系四年级学生共青团员江悦琴，护校学生、共产党员朱根梅被选中了，两位年轻的姑娘身上注射进混合菌后，躺在床上等待反应，她俩焦急地彼此询问：“你难过吗？”“你发烧吗？快点烧起来就可以给他输血了。”3天后，当她们烧退后去看望邱财康时，面对两位质朴可爱的姑娘，这个大男人强忍住眼泪，反复说着：谢谢，谢谢！,经过综合治疗，邱财康的败血症被控制住了。但他经过植皮的腿又开始化脓了，植上去的皮一块块掉下来，整个右腿严重感染，有些地方肌肉也开始腐烂。要不要截肢，专家们开始了激烈的讨论。7月，上海当时最著名的内外科专家都被请到广慈医院会诊了3次，最
26、后，一致同意采用余贺教授从国外文献中看到的用噬菌体进行治疗。余教授发动上海第二医学院微生物教研组人员带领60名同学接连几天到市郊掏粪坑，找污水，把粪水、污水带回学校，经过多次培养、繁殖，并得到了上海生物制品所的协助，噬菌体终于被用到了邱财康腿上。不到1天时间，精湛的医术发挥了神效：绿脓杆菌在噬菌体这个天敌前乖乖“投降”了。邱财康的腿终于保了下来，支撑着他，继续着美好的人生路。1964年1月20日，国家卫生部举行大会，表彰广慈医院抢救钢铁工人邱财康的巨大成绩。对瑞金医院而言，成功抢救一位烧伤面积超过的病人创造了医学发展史上的奇迹，也自此奠定了瑞金灼伤学科的基础；而对邱财康而言，是重新赢回生命，重新赢得生活。,第4次课思考题: (1) 消毒(disinfection) 灭菌(sterilization) 生物安全（biosafety） 毒性噬菌体(virulent phage) 温和噬菌体(temperate phage) (2) 简述病原微生物的分类与病原微生物实验室的分级,预习：第5章 细菌的遗传与变异,
