1、腺相关病毒介导的囊性纤维化基因治疗,分享小组：,1.基因治疗,2.囊性纤维化（CF）,6.囊性纤维化跨膜电导调节,3.腺相关病毒（AAV）,5.腺相关病毒血清型5(AAV5),目录,4.腺相关病毒2型（AAV2）,基因治疗（gene therapy）,基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。,囊性纤维化（CF）,囊性纤维化是一种由常染色体(第7
2、对)隐性遗传的严重的外分泌腺疾病。主要影响胃肠道和呼吸系统，通常具有慢性梗阻性肺部病变、胰腺外分泌功能不足和汗液电解质异常升高的特征。,囊性纤维化基因治疗的优势,1.囊性纤维化是一个单基因疾病（CFTR突变） 2.受影响最严重的器官是肺，可以轻松访问 3.它是一种渐进性疾病，与一个几乎在出生时表型正常的患者提供了一个有利的治疗时间。,囊性纤维化（CF）,发病早期出现支气管腺体肥大、杯状细胞变性支气管粘液腺分泌出粘稠分泌物支气管堵塞肺不张和继发性感染支气管炎、肺炎、支气管扩张、细支气管扩张、肺脓肿肺部广泛纤维化和阻塞性肺气肿肺通气不足，吸入气体分布不均，通气与血流比例失调以及弥散功能障碍，出现缺
3、氧和二氧化碳潴留症状呼吸衰竭同时肺循环阻力增加，引起肺动脉高压和肺源性心脏病。其他症状：胰腺功能不全，胆道阻塞，不孕不育，男性，高氯水平汗水，肠梗阻，形成鼻息肉，慢性鼻窦炎，粘液脱水，慢性绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌肺部感染。,囊性纤维化基因治疗的挑战,基因治疗面临的主要挑战是安全运送患者细胞的转基因载体的选择。 用于基因治疗的理想载体必须具有一定的特性： a）提供的感兴趣的基因的载体必须具有足够的能力来执行必要的遗传信息，免疫系统无法检测 b）具有非炎症 C）是安全的人类宿主,目前，用于基因治疗囊性纤维化的最大的挑战是找到一个理想的载体提供的转基因（CFTR），为受影响的器官（肺）。腺相关病毒是
4、最有希望用于治疗呼吸系统疾病的病毒载体系统，因为它具有自然取向的气道上皮细胞，并不会造成任何人类疾病。,基因治疗、囊性纤维化与腺相关病毒,属微小病毒科(Parvoviridae)家族成员，无被膜而具有二十面体结构，含线状单链DNA基因组(5kb)。从昆虫到人类都已分离出该病毒，其复制依赖于其他辅助病毒，如腺病毒、痘苗病毒等。,腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是简单的非病原单链DNA，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。它编码两个末端的反向重复序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep
5、基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。,腺相关病毒（AAV）,野生型腺相关病毒（AAV）的基因组的图谱。 rep和cap基因两侧的反向末端重复序列（ITR），三个（P5，P19和P40），Rep蛋白在病毒复制过程中（Rep78，Rep68，Rep52和Rep42），三个Cap蛋白在病毒衣壳的形成（VP1 ，VP2，VP3）。cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep基因参与病毒的复制和整合。,腺相关病毒2型（AAV2）,在不同AAV血清型，腺相关病毒2型（AAV2）是目前研究最多，它进入靶细胞，通过细胞受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖
6、（HSPG）和细胞不表达HSPG秀AAV2（41）对感染的抵抗力使用的协同受体，通过内吞作用进入细胞内的内化。AAV感染的基因治疗成功后的内吞作用，AAV载体应该摆脱内吞囊泡，进入细胞核，通过核孔复合体，促进基因的表达，如CFTR（下图所示）,进入细胞的腺相关病毒（AAV）载体和贩运。 AAV载体进入细胞通过内吞作用的受体介导的方式，通过网格蛋白涂覆的凹坑。后的内吞作用，应该从内体逃逸的腺相关病毒载体，通过核孔复合物进入细胞核，并促进基因的表达（囊性纤维化跨膜电导调节器，CFTR）。,AAV2载体在CF基因治疗的应用及囊性纤维化跨膜电导调节,AAV2载体已建成的企图提供的CFTR基因气道上皮细
7、胞，并恢复CFTR蛋白的表达。高效表达重组腺相关病毒相关的囊性纤维化跨膜电导调节器载体（腺相关病毒-CFTR）,观察实验，单纤维支气管镜交付。并且I期临床试验表明，AAV-CFTR的气溶胶单剂量是安全的，耐受性良好，适于CF患者与轻度肺部疾病。三分之一的I期临床试验中观察到了类似的结果,A,研究表明rAAV2载体，含有该DNA的绿色荧光蛋白（GFP;三种剂量的4109颗粒）会引起温和的影响在小鼠的呼吸道和肺实质的炎症反应。组织学研究结果表明，在第一次接种后，它可以检测肺实质的变化。正常区域和折叠区域的百分比减少，增加，分别在各组动物接受气管内的病毒载体。然而，这些形态学变化不足以诱导肺功能的变
8、化。,AAV2载体技术主要限制这些临床前和临床试验的基础上，需确认： 1.低丰度的的AAV2受体和辅助受体的顶面的气道 2.相对低效率的AAV-ITR启动 3.rAAV2颗粒细胞外的障碍，包括弹性蛋白酶，防御素和其他物质 4.持续时间短的基因转移与快速周转的CF气道上皮细胞的重组腺相关病毒基因组的后续损失，失活 5.发展限制的效率或重复的载体的主管部门由病人的中和抗体。,早期的工作表明，血清型AAV1，AAV5的和AAV6比AAV2能够更好地转移到肺细胞。这可能是由于受体AAV2的肺上皮细胞的顶端表面上的数目减少了。含有的CFTR基因的编码部中的病毒基因组的变化也被试图改进用于表达的能力，例如
9、，包含某些元素和使用其他的转录的启动子区域显示了改善后转录的能力。,腺相关病毒5型（AAV5）,AAV5载体比AAV2对CF基因治疗更有效,rAAV5矢量-CB，携带的CFTR基因与在N-末端的缺失（AAV5-CB-264CFTR）能够纠正缺陷氯运输在CF支气管细胞系在体外，有证据表明，AAV5载体更有效地为CF基因治疗比AAV2。 zabner等建议AAV5可以增加50倍，在人的气道上皮细胞相比AAV2的基因传递。沃尔特斯研究表明，气道上皮细胞顶膜中包含的高亲和性受体AAV5，AAV2的，它具有其受体位于基底膜相反。 AAV5需要连接到细胞基因转移的唾液酸（2,3 - 连接的唾液酸）。,囊性
10、纤维化跨膜电导调节,2005,进行实验，以克服AAV基因组的能力有限;他们的CFTR的的监管的域名（CFTRR）和CMV启动子的部分删除。被删除的元素（启动和CFTRR）和被打包的ITR在rAAV5和施加到差别化，CF气道上皮细胞的顶端表面。 2至4周后，AAV5向量部分纠正CF气道上皮细胞的氯离子转运，有缺陷的，管理一个单一的腺相关病毒载体本身可以纠正CF CL-CF气道上皮细胞在分化的运输缺陷提供了第一手的证据。然而，几个剂量，以维持所需的转基因表达的气道，因为转基因表达的持久性是有限的。 Martini等，使用rAAV5-GFP，表明rAAV5（41011粒子）是安全的基因转移到小鼠肺部
11、。免疫组化结果表明重新给药（3个剂量）的rAAV5载体信息，在经处理的动物的肺的报告基因（GFP）的持续表达。此外，重复给药的rAAV5并没有引起炎症过程，细胞凋亡，或机械或肺部的形态变化。这些结果与以前的研究表明AAV5是一个很好的CF基因治疗载体。,AAV用于CF的优势,1.AAV具有天然嗜性气道上皮细胞 2.AAV引出很少或根本没有炎症反应 3.AAV在宿主中稳定表达 4.位点特异性整合的AAV不激活可能的致癌基因和一个相对长的时间内，可以保持插入的基因在宿主细胞中的基因组，并稳定地在体内表达。,未来的发展方向,在使用CF基因治疗的腺相关病毒载体虽然已经取得了显著进步。 重组腺伴随病毒转导的效率依赖于相互作用的病毒与宿主细胞，其中包括与细胞受体结合，以克服细胞内的障碍，限制病毒核积累。规范这些属性可以提高效率和安全性的基因治疗。使用腺病毒载体，以提高效率的一种策略相关的突变AAV2矢量与建造。 AAV基因转移能提高其转导，AAV仍然是一个很有前途的输送系统CF基因治疗，主要是因为其缺乏气道的致病性和免疫原性。然而，越来越多的数据需要不同的血清型，假的和突变的腺相关病毒载体转基因交付的有效性。,谢谢聆听 ！,分享小组:,
