1、刘军 博士 加拿大多伦多大学医学遗传和微生物系 终身教授 多伦多大学肺结核和艾滋病研究中心 主任 加拿大McLaughlin 分子医学中心 科学家 加拿大国立卫生研究院 研究员 中国国家自然科学基金国家杰出青年(海外) 成都永安制药有限公司 研发总监,结核诊断新技术的理论探讨,世界结核病疫情,目前全球1/3的人口（约20亿）已经感染了结核菌，每一秒钟就会产生一位新的感染者，如不控制，近10年将有3亿人受感染. 全球有2000万人患结核病，每年新发病人数达800-1000万人，全球每年约300万人死于结核病。与艾滋病、疟疾并列为影响全球健康的三大传染病杀手. 与艾滋病形成致命的交叉感染 30%的
2、HIV携带者死于结核. 耐药结核在全球的出现和持续增加 (20%), 严重威胁目前结核的有效治疗,我国结核病疫情,中国结核病患者数量居世界第二位，每年因结核病死亡的人数大大超过其他传染病死亡人数的总和，且中国人群结核分枝杆菌感染人数达到5.5亿。（卫生部副部长王陇德2006年新闻会客厅语）,我国结核病疫情,我国2003年对结核病的治愈率平均已达到87%以上，但对结核病的发现率约为29%。发现率极低已成为我国有效控制结核病大规模传染的最大障碍和隐患！ 世界卫生组织已向我国明确提出，要求尽快将结核发现率提高到70%以上。,结核病传统的常规诊断方法,结核病诊断方法现状,菌阳肺结核病诊断: 痰涂片,
3、痰培养方法:敏感性(检出率)低, 时间长,肺外结核、排细菌较少的结核病人诊断困难，几乎很难检测到 菌阴肺结核病诊断:皮下结核素,X-光方法, 病理综合诊断:敏感性(检出率)低, 特异性差, 假阳性高 同时使用以上四种诊断方法对疑似病人进行筛选，在中国的发现率低于30%. 全球目前对于菌阴结核的诊断没有有效和统一的方法和标准. 而菌结核可占结核病人的60-70%.,结核病诊断方法发展趋势,目前国际学术界正竭力寻找： 特异性高的结核分枝杆菌抗原 结核分枝杆菌特异性靶位DNA序列以便作为免疫诊断或分子生物学诊断的基础，为准确诊断结核病提供依据。,国际市场现有分子生物学诊断试剂,国际市场上PCR试剂盒
4、的主要缺陷,操作复杂: 由于所选用的靶位基因特异性差, 需要多步骤的操作,检测的基因对象特异性差: 许多不同的靶位序列包括DNA和RNA片断被推荐使用,但最普遍的是16S 核糖体(ribosomal) DNA (rDNA),16S 核糖体RNA(rRNA) 和IS6110重复片断.这些基因片断的特异性差.,价格昂贵,虽然Gen-Probe公司的AMTD和Roche公司的AMPLICOR早在1996年已被美国FDA批准上市，但是这些试剂盒在包扩美国在内的发达国家医疗机构中的推广应用却很有限，其最主要原因是它们的价格昂贵。Dowdy等人在美国医院所作的研究表明，Gen-Probe公司AMTD试剂盒
5、用作痰涂片阳性病人诊断的最低费用为338美元/每人，而用作早期排除病例(根据AMTD阴性结果判断)的费用为494美元/每人。Dowdy等人更进一步比较了治疗结核病人的费用(201美元/每人)并得出结论：AMTD试剂盒不是经济实效(cost effective)的手段。可想而知, 这些诊断试剂在结核病高发的发展中国家的推广应用更为有限。,国际现有血清免疫诊断试剂,现有血清诊断方法的缺陷,其他选用抗原：14 kDa, MPT63, 19 kD, MPT64, MPT51, MTC28, A85B, KatG, Esat-6等 灵敏度不够高：12-58%，尤其是菌阴病人 容易产生假阳性：所选用的抗原
6、在非结核分枝杆菌, 尤其是环境中的分枝杆菌 (environmental mycobacteria)中也存在, 从而导致交叉反应,Mycobacterium Genus (分枝杆菌属类),包括85个种 (Mycobacterium species) 人类致病菌: 肺结核分枝杆菌(M. tuberculosis),牛型分枝杆菌(M. bovis), 通称为M. tb complex 麻风分枝杆菌(M. leprae) 机会感染菌: 免疫能力低下者感染 M. avium-intracelluare complex (MAC), M. marinum, M. fortuitum, M. ulcera
7、ns, M. terrae, M. kansasii, M. genavense, M. chelonae, M. xenopi, M. abscessus 环境中的分枝杆菌: 占大多数, 不引起疾病 M. smegmatis, M. vaccae, M. aurum,诊断检测对象(靶位),S.T. Cole, et al. Nature (1998) 393:537-544,结核分枝杆菌H37Rv基因组: 4,039个基因(ORF),分枝杆菌基因组测定,M. tuberculosis CDC1551: 4237 基因 M. bovis: 3970 基因 M. bovis-BCG Pasteu
8、r: 4004基因 M. leprae: 1655 基因 M. avium: 5170 基因 M. paratuberculosis: 4398 基因 M. marinum: 5485 基因 M. ulcerans: 4210 基因 M. gilvum: 5296 基因 M. vanbaalenii: 6037 基因 M. smegmatis: 6770 基因Mycobacterium sp. KMS: 5527 基因 Mycobacterium sp. JLS : 5796 基因,致病菌,环境中的 分枝杆菌 (非致病菌),Presence of IS6110 is variable in c
9、linical strains,Moatter, T. et al., 1998, Detection of Mycobacterium tuberculosis in paraffin embedded intestinal tissue specimensby polymerase chain reaction: characterization of IS6110 negative Strains. J. Pak. Med. Assoc. 48, 174-178.,IS6110 is absent in some clinical strains of M. tuberculosis,V
10、an soolingen et al., 1993, Comparison of various DNA repetitive elements as genetic markers for strain Differentiation and epidemiology of M. tuberculosis.J. Clin. Microbiol. 31,1987-1995.,M. tuberculosis CDC1551: 4237 基因 M. bovis: 3970 基因 M. bovis-BCG Pasteur: 4004基因 M. leprae: 1655 基因 M. avium: 51
11、70 基因 M. paratuberculosis: 4398 基因 M. marinum: 5485 基因 M. ulcerans: 4210 基因 M. gilvum: 5296 基因 M. vanbaalenii: 6037 基因 M. smegmatis: 6770 基因Mycobacterium sp. KMS: 5527 基因 Mycobacterium sp. JLS : 5796 基因,致病菌,环境中的 分枝杆菌 (非致病菌),TB-SA抗原 存在,TB-SA抗原 不存在,TB-SA 基因/蛋白具有技高的特异性,血清诊断的理想抗原- TB-SA蛋白抗原,TB-SA具有极高的特异
12、性，只存在于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和与其紧密相关的同类致病菌中。 TB-SA基因的表达，只有在结核杆菌侵入人体巨噬细胞（macrophages）内才发生。排除接种卡介苗的人群对实验结果的影响，有效控制假阳性。 TB-SA抗原蛋白是一种分泌性蛋白，容易被机体识别并引起免疫应答从而产生特异性抗体，是结核分枝杆菌血清诊断的理想抗原。,PCR检测的理想对象 -TB-SA基因,TB-SA基因只存在于结核分枝杆菌和其它几种致病的分枝杆菌中，具有极高的特异性，可以避免由非致病的分枝杆菌和其它不相关细菌而引起的交叉反应； TB-SA基因是结核杆菌染色体上的基因，不
13、是移动子，因此在所有的结核分枝杆菌菌株中都稳定存在。 TB-SA同源基因的DNA序列不完全一致，因此可以通过设计引物而检测DNA序列有差别的片段将结核杆菌从其它分枝杆菌中区分出来。,CYPCO试剂的研究基础,在上述研究的基础上与成都永安制药有限公司成功开发出 结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法） 结核分枝杆菌（TB-SA）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒,CYPCO试剂的临床研究,临床研究单位多中心 北京结核病胸部肿瘤医院（组长单位） 山东省胸科医院 成都市结核病防治院 临床研究考核方法采用双盲法 临床考核对象 细菌学检查及临床诊断为结核病患者（菌阳、菌阴、肺外结核）； 细菌学与
14、临床诊断为非结核病的呼吸系统疾病或肺癌患者； 无肺部疾患的健康志愿者。 临床研究样本量远远大于国内外文献中所报道的临床试验,入选病例分布,结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核,(包括健康人群和其他肺部疾病: 健康人群特异性:86.4%;其他肺部疾病特异性:80.2%),结果分析,结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核,20 mm,TB-SA ELISA not influenced by PPD reaction,P=0.98 between data of (20 mm),结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核,结核分
15、枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核 提高了菌阴结核病及肺外结核病的检出率,结 论,对菌阴肺结核和肺外结核诊断价值高。 与传统的涂片法和培养法比较，该方法明显提高结核病的阳性检出率，具有统计学意义。 操作简便，快速，价格低廉，无需特殊仪器，适合基层医院，可作为临床结核病诊断和鉴别诊断的辅助手段。 TB-SA ELISA试剂盒对结核病人的诊断不受患者PPD反应的影响。这对在卡介苗广泛推广的高危地区的推广应用有积极意义。,结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核,入选病例分布,结核分枝杆菌核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒临床应用考核,结果分析,结核分枝杆菌核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒临床应用考核,对涂片、培养漏检标本的高检出率 850例结核病人PCR、培养、涂片阳性检出率比较,结核分枝杆菌核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒临床应用考核,高特异性有助于临床诊断和鉴别诊断,结核分枝杆菌核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒临床应用考核,THANK YOU！,
