1、细胞色素C、线粒体 与 细胞凋亡,生物技术1班 81050434 孙铭泽,细胞色素C、线粒体与细胞凋亡,细胞凋亡概念 凋亡细胞的变化 线粒体、细胞色素C 凋亡的检测,细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。,细胞凋亡（apoptosis）,是细胞的多基因协同调控的程序性死亡过程，是维持细胞数目均衡和组织大小，保证机体正常生长发育的先决条件。很多肿瘤的发生不仅是细胞增殖的加
2、快，凋亡受抑也是肿瘤发生的一个重要因素。促凋亡基因的表达增强或凋亡抑制基因的突变或缺失是使正常细胞恶性病变的重要原因。目前已被认识和克隆的与肿瘤细胞凋亡相关的基因有p53, c-myc及Bcl-2家族蛋白等。它们受外部或内部信号的刺激被激活或阻断来促进或抑制肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡是抗肿瘤的主要机制之一。,细胞凋亡,细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎.胞膜有小泡状形成，质膜脂双层膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体凋亡。小体可迅速被周围专职或非专职吞噬
3、细胞吞噬,利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。,1形态学变化,2生物化学变化,）染色体DNA的降解：,）RNA/蛋白质大分子的合成。,）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。,细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，这种DNA的有控降解是内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电
4、泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。,细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往 往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如在糖 皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合 成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。,近年来人们对凋亡的认识已经从细胞核的改变决定凋亡,发展为重视线粒体,因为它构成了细胞存亡的控制中心。凋亡过程中线粒体呼吸链电子传递中断,自由基产生,能量供应受阻。在检测到经典的细胞凋亡特征以前,线粒体膜完整性就已发生了重大变化。这些变化涉及到线粒体内膜和外膜的改变,包括内膜跨膜电位的丧失和(或) 蛋白质通
5、过外膜的释放。线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来越引起人们的重视, 一方面是由于线粒体膜间隙的细胞色素C 释放至胞质后触发caspase 级联,导致细胞死亡;另一方面,线粒体外膜上的Bcl-2 蛋白家族调控细胞色素C 自线粒体的释放。因此细胞色素C 是哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因素,对细胞色素C 释放的研究是目前的研究热点。,线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要地点。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH。NADH通过线粒体内膜呼呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量合成AT
6、P。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。,近年来发现线粒体跨膜电位与线粒体通透性改变在细胞凋亡过程中起重要作用，并且还有人提出了线粒体通透性改变孔道复合物的假说。如果线粒体融合过程出错，错误的细胞就会死亡，进而导致疾病的发生.到目前为止，研究人员虽然知道某些疾病是因为线粒体融合出错引起，但对线粒体融合本身还不甚了解。研究组设计了不同的方案来跟踪研究线粒体融合过程。他们看到了两个明显的阶段：首先，外膜融合并形成一个有一个外膜和两套内膜的中间体结构；然后，内膜发生融合。,近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于
7、磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。线粒体解联的呼吸链会产生大量活性氧，氧化线粒体内膜上的心磷脂。实验证明，用解偶联剂mClCCP会导致淋巴细胞凋亡。而如果能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。,在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)。,2 线粒体通透性转变孔道,1 线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系,PT孔道由线粒体各部分的蛋白质与细胞质中蛋白质联合构成。这包括细胞液蛋白：己糖激酶，线粒体外膜蛋白：外周苯并二嗪(b
8、enzodiazepine)受体与电压依赖阴离子通道，线粒体膜间隙蛋白：肌酸激酶，线粒体内膜蛋白：ADP-ATP载体，线粒体基质蛋白：亲环蛋白D(cyclophilin D)等。凡是能够专一作用于线粒体诱导PT孔道生成的物质，例如苯并二嗪受体的配基原卟啉IX等都能引起细胞凋亡。 促凋亡信号会使Caspases激活、胞浆Ca2+水平升高等，诸如此类的改变会直接或间接地引发PT孔道。PT孔道定位于内外膜接触点,并可以无选择性地允许1.5kD分子通过。这个通道的开放会由于线粒体基质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，能量产生中断；还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂，释放出包括Cyto
9、-c在内的各种活性蛋白。,PT孔道,在诸如细胞毒药物诱导细胞凋亡的信号转导途径中，线粒体在促凋亡信号和Caspases激活之间起着不可替代的作用。实际上， 线粒体在细胞凋亡中的作用远不止此。线粒体在细胞凋亡中的作用包括：释放Caspases激活因子如Cyto-c；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与BCL-2蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相关等方面。甚至有人提出：线粒体在细胞凋亡中起着决定性的作用。实验证明，辐射、Fas与配体结合等均可导致线粒体在电子转移方面功能的紊乱，从而影响呼吸链，ATP产量下降。这种能量代谢上的障碍主要发生在细胞凋亡的晚期。 线粒体在细胞凋亡中的重
10、要性还在于它与Bcl-2基因家族之间的关系。实际上，很多Bcl-2家族的蛋白如BCL-2、BAX、BCL-XL等都定位于线粒体膜上。而且实验证实，BCL-2家族蛋白可以影响PT通道开放及其Cyto-c、AIF的释放，还可以改变线粒体外膜的通透性。如BAX一方面可以直接促使线粒体膜内的大小约为12kD的Cyto-c在外膜未被破坏的情况下释放至胞质；另一方面，又可以激发PT通道的开放。而BCL-2蛋白则起抑制作用。,线粒体在细胞凋亡中的重要性,线粒体在细胞凋亡中的重要性,线粒体在细胞凋亡过程中最重要的一点在于它可释放能够激活Caspases的蛋白。在无细胞的体系中，自发的、可以由Bcl-2抑制的染
11、色质聚集和DNA片段化依赖于线粒体的存在，进而发现实际上是依赖于Cyto-c从线粒体中的释放。从线粒体释放的Cyto-c与Apaf-1、Procaspase 9结合在一起形成“凋亡体”（Apoptosome），其结果是Caspase 9的激活。除Cyto- c之外，线粒体还可释放其它介导细胞凋亡的分子：Procaspase 3和AIF（Apoptosis-inducing factor）。AIF在体外可作用于Procaspase 3，并且其本身可能就是一个Caspase。,Cytochrome c, is released from mitochondria in response to ap
12、optotic signals, and activates Apaf-1, a protease released from mitochondria. Activated Apaf-1 activates caspase-9 and the rest of the caspase pathway. Smac/DIABLO is released from mitochondria and inhibits IAP proteins that normally interact with caspase-9 to inhibit apoptosis. Apoptosis regulation
13、 by Bcl-2 family proteins occurs as family members form complexes that enter the mitochondrial membrane, regulating the release of cytochrome c and other proteins. Bax, another Bcl-2 family member, is activated by this pathway to localize to the mitochondrial membrane and increase its permeability,
14、releasing cytochre c and other mitochondrial proteins. Bcl-2 and Bcl-xL prevent pore formation, blocking apoptosis. AIF (Apoptosis inducing factor)induced apoptosis is important during development but is not caspase dependent.,cytochrome C together with Apaf-1 and ATP forms a complex with pro-caspas
15、e 9, leading to activation of caspase 9 and the caspase cascade. Since Bax, and other Bcl-2 proteins, show structural similarities with pore-forming proteins. It has therefore been suggested that Bax can form a transmembrane pore across the outer mitochondrial membrane, leading to loss of membrane p
16、otential and efflux of cytochrome C and AIF (apoptosis inducing factor). It is thought that Bcl-2 and Bcl-XL act to prevent this pore formation. Heterodimerisation of Bax or Bad with Bcl-2 or Bcl-XL is thought to inhibit their protective effects. It is also thought that proteins such as Bax and Bad
17、can promote the formation of the large diameter PT pore, with subsequent loss of cytochrome C and initiation of apoptosis.,细胞色素C 是线粒体呼吸链的重要组成部分,它是由两个无活性的前体分子合成的:前细胞色素C(该蛋白质由细胞核基因编码,然后被转运至线粒体) 和亚铁血红素(由线粒体合成) 。由于细胞色素C 具有亚铁血红素基团,它可以在呼吸链复合酶(细胞色素还原酶) 和IV (细胞色素氧化酶) 之间传递电子。细胞色素C 缺乏时,电子传递链被阻断,将导致两方面的后果:ATP
18、合成减少及不完全氧化造成的超氧阴离子(ROS) 过度生成,而ROS 是诱导凋亡的重要因素。,1 细胞色素C释放在凋亡中的作用,近年来对细胞色素C 的认识已经从其对能量代谢的控制而进展为对其参与凋亡过程的研究。在凋亡过程中起重要作用的不只是线粒体呼吸活性的丧失,更重要的是细胞色素C 自线粒体的释放。正常情况下细胞色素C 是一个定位于线粒体膜间隙的相对分子质量为1145 104 的水溶性蛋白质,电稳定性地结合于线粒体内膜,不能通过外膜。凋亡过程中细胞色素C 通过线粒体外膜释放,在ATP/dATP 的参与下,在胞质中与Apaf-1 结合形成寡聚体,Apaf-1 通过其氨基端和procaspase 9
19、 的功能前区相互作用,导致caspase 3 激活, 并进一步激活下游的caspases。caspase 3是caspase 家族最重要的凋亡执行者(executioner) 之一,它可自身切割,在凋亡的执行阶段,负责对全部或部分关键性蛋白的酶切作用(激活或灭活) 。Na2gata 实验室在胞质内找到一种能将染色质切割的核酸酶,该酶需首先藉caspase 3 激活, 称 CAD 。CAD 能在DNA 上识别一定的序列并在该处使其断裂而成“梯形染色质”(chromatin ladder) 。,除细胞色素C 外,凋亡过程中从线粒体膜间隙释放的蛋白还包括一些caspases (主要是caspase
20、2 ,3 , 和9) 前体, 以及不依赖于caspase 的凋亡诱导因子(apop2tosis inducing factor , AIF) 。克隆分析表明AIF 是一相对分子质量为517 104 的黄素蛋白,它与细菌铁氧还原蛋白和NADH 氧化还原酶具有高度同源性。AIF 一旦释放至胞质即可直接到达细胞核,以一些尚不清楚的机制激活一种可水解细胞核DNA的核酸内切酶。而细胞色素C 则通过触发caspase级联引起继发性核酸内切酶活化。有证据表明细胞色素C 介导的凋亡不同于AIF介导的途径。首先,AIF 的释放发生于线粒体去极化之后,而有些报道指出细胞色素C 自线粒体的释放发生于膜电位降低之前。
21、其次,胞质细胞色素C 通过参与激活caspase 3 触发凋亡,而AIF 则直接诱导细胞核凋亡。最后,细胞色素C 参与凋亡需要其它的胞质因子如Apaf-1 ,而AIF 一旦从线粒体释放即可在无胞质的情况下发挥作用。这两种不同的凋亡诱导途径提示了哺乳动物细胞死亡机制的复杂性和多样性。它们可能对应于不同的死亡触发刺激和执行程序.或者,相反地,它们可能一起诱导完整的凋亡。,细胞色素C与凋亡诱导因子( AIF),凋亡的早期检测,1） PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测: 2）细胞内氧化还原状态改变的检测： 3） 线粒体膜电位变化的检测： 4）细胞色素C的定位检测,线粒体凋亡是细胞凋亡的重要组成部分
22、，其发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体跨膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。这种原理可以检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。,线粒体膜电位变化的检测：,细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之
23、间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。 Apo Alert TM Cell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。,细胞色素C
24、的定位检测,The end,Thank you!,这一家族有众多成员，如Mcl-1、NR-B、A1 、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它们分别既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多数成员间有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。Bcl-2成员之间的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，在一些白血病中Bcl-2呈过度表达。 Bcl-2的亚细胞定位已经明确，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。此外， Bcl-2具有保护细胞的功能
25、， Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽（GSH）的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从胞液迁移到线粒体和核膜。有人研究发现，细胞毒性药物诱发凋亡时，核膜Bax水平的上升与lamin及PARP两种核蛋白的降解呈正相关。用Bax寡核苷酸处理的细胞，只能特异地阻断Lamin的降解，对PARP的降解不起作用。这种效应的调控机制目前仍然不清楚。 总之，细胞凋亡的调节是非常复杂的，参与的分子也非常多，还有很多不为我们所知的机理需要我们一步的探索。,Bcl-2家族：,caspases 是一组与秀丽隐杆线虫( C. elegans)同源的执行哺乳动物细胞凋亡的主要蛋白酶家族,通常它们以无活性的酶原(procaspase) 形式存在于胞质内,当有致凋亡刺激存在时被激活。,
