1、1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒,实验五,实验目的,掌握质粒提纯的原理和方法; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶.,预习：基因克隆示意图,基因克隆操作过程：,基因载体（gene vector）,什么是基因载体把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具基因载体的作用为目的基因提供进入受体细胞的转移能力为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件,基因载体应具备特点,1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增 2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达能力） 3.具有适当的限
2、制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）,6,基因载体类型,质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC）,7,一.质粒DNA的制备,1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？,8,(1)质粒的定义质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形
3、式存在。,9, 超螺旋DNA(SC DNA),(2)质粒的三种构型,10, 开环DNA(open circular DNA,OC DNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。,11, 线状DNA(linear DNA,L DNA):如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）,12,(3)质粒DNA的一般特性：质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。,13,(4)提取质粒DNA的目的与意义（？）基因载体/基因克隆/基因工程,2 提取
4、质粒DNA的常规方法:2.1 核酸分离纯化的总原则： 保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）,2.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤,培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） 细菌的收集与裂解收集高速离心的方法 质粒DNA的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。,3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA 3.1 实验原理： 在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA断裂成不同长
5、度的双链DNA。,16,强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离； 当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。,17,如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。,18,3.2 主要试剂及作用,溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过
6、程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）,19,溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）,20,溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用)HAC溶液能中和溶液的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
7、沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。,实 验步骤及注意事项,加1.4ml培养物于EP管，12000rpm30S 除去上清，再取1.4ml离心30s 除去上清，加入冰的100 l溶液I，颠倒EP管，混匀加入200l溶液II，温和混匀，冰浴35min加入150l冰溶液III，温和混匀，冰浴35min，12000rpm5min 转移上清到新EP管，加入等体积酚和氯仿/异戊醇，12000rpm5min 转移上清到新EP管，加入等体积氯仿/异戊醇，12000rpm5min 上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 冰箱中放置2
8、0min，120005min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室温静置1015min ， 20 l TE 溶解DNA,注意事项：1、加样枪正确使用；2、标记自己所提取的质粒类型（pUC119-U6 ）；3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要换枪头；5、离心前把管擦干；6、转移上清时不要吸到沉淀；7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤。,二、限制性内切酶切割重组质粒,1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 定义能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片
9、段。主要存在于细菌体内。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。,24,作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。,分类 、 （基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口
10、,影响限制酶活性的因素,1）“星”活性酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。EcoR：GAATTCEcoR*： AATT 2）甲基化识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 3）底物性状 4）试剂：缓冲系统,pUC18/19酶切位点的分布示意图,2 BamHI 、Hind酶切重组质粒及鉴定,1 实验原理：利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）,31,重组质粒,BamHI,Hind III,双酶切,电泳检测,2 实验材料:重组质粒; BamHI 、Hind 限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。,33,3 实验步骤: A 建立反应体系 B 酶切反应（温育1-3h） C 电泳鉴定,34,4、双酶切体系（0.2mlEP管）： 质粒DNA 10l10M buffer 2lBamH 1lHind 1lddH2O 6l,35,合计 20l,酶切混合液10 l,同学自己加,37 ，12h,*剩余质粒交给老师，连同酶切产物下次电泳鉴定,思考题？,质粒DNA制备与基因组DNA制备有哪些异同？ 质粒DNA的鉴定有哪些方法？ 基因载体应该具备哪些特点？ 为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？,36,
