1、1,肺炎球菌结合疫苗质量控制,中国药品生物制品检定所,2,大纲,肺炎球菌疾病概况 肺炎球菌疫苗 肺炎球菌结合疫苗质量控制,3,Serotype 19F; Photograph by Rob Smith,格兰氏阳性双球菌 外覆多糖荚膜 根据荚膜构成不同，分为40个血清群（serogroup)和90多个血清型（serotype) 荚膜是主要的毒力因子 针对荚膜多糖产生的抗体具有保护性，是疫苗的基础,肺炎球菌,100 nm,4,肺炎球菌性疾病: 发病机理,菌血症性 肺炎,脑膜炎 败血症,中耳炎, 鼻窦炎, 非菌血症性肺炎,进入血流,局部侵润,定植,穿越粘膜屏障,侵袭性疾病（IPD）,非侵袭性疾病,5
2、,疫苗可预防的死亡 2002年WHO报告,* Source: WHO Global Immunization Vision and Strategy, April 2005 www.who.int/vaccines/GIVS/english/Global_imm._data_EN.pdf *2003 data,6,肺炎球菌侵袭性疾病（IPD）(按年龄分),*Rate per 100,000 populationSource: Active Bacterial Core Surveillance/EIP Network,7,肺炎球菌是引起儿童脑膜炎的 主要致病菌之一,安徽大学附属医院脑膜炎研究
3、1-16岁脑膜炎脑膜炎分离株共109株 脑膜炎球菌34株 金黄色葡萄球菌25株 肺炎球菌17株,周仲松，于鑫之，李家斌。中枢神经系统感染280例的类型与病原菌分析J. 中国抗感染化疗杂志, 2002,2(3):173-176,8,1982-1985年全国18省市肺炎球菌调查,由中国药品生物制品检定所负责，29个省市级医疗科研单位参加 与WHO进行国际合作 在肺炎（血液）、脑膜炎（脑脊液）和中耳炎（中耳渗出液）患者采集标本，分离肺炎球菌 总例数10446，分离出肺炎球菌782株,肺炎球菌分型研究协作组. 我国18省（市）肺炎球菌血清型及其感染的流行病学研究J. 中华流行病学杂志, 1989,10
4、(3): 133-136,9,1982-1985年全国18省市肺炎球菌调查,肺炎球菌对婴幼儿的威胁很大 1岁以下婴儿占46.5% 1岁以下的婴儿肺炎的病死率达28.6%，脑膜炎的病死率达17.2% 成人和儿童的常见血清型差别较大 成人常见的前6个血清群为：1，5，3，6，8，18 儿童常见的前6个血清群为： 5，6，19，2，4，23,10,肺炎球菌耐药已迅速发展为国际性问题,11,我国肺炎球菌对抗生素耐药呈升高趋势,1,1,2,3,1.李洁, 杨永弘,等. 肺炎链球菌对抗生素耐药性的研究. 中华儿科杂志, 1999,37(7):408-411 2.姚开虎，陆权等. 2000-2002年北京、
5、上海和广州儿童肺炎链球菌携带和耐药监测. 中华医学杂志，2005; 85(28): 1957-1961 3. 中国住院儿童肺炎流行病学调查：4家医院研究结果. Data on file. 惠氏制药有限公司,耐药率,12,肺炎球菌多重耐药增加,同时对3种或3种以上抗生素耐药的比例 1997年对北京244株儿童鼻咽拭子分离菌株的研究1 48.7%菌株同时对氯霉素、红霉素、四环素、和/或TMP/SMZ耐药 2000-2002年北京、上海、广州研究结果达88.7% 2,1.王辉, 陈民均. 北京地区肺炎链球菌的耐药性及其分子流行病学调查. 中华医学杂志, 1999, 79(4):253-256 2.姚
6、开虎，陆权等. 2000-2002年北京、上海和广州儿童肺炎链球菌携带和耐药监测. 中华医学杂志，2005; 85(28): 1957-1961,13,大纲,肺炎球菌疾病概况 肺炎球菌疫苗 肺炎球菌结合疫苗质量控制,14,肺炎球菌疫苗,目前已上市可用于预防肺炎球菌性疾病的疫苗有两种； 二十三价肺炎球菌多糖疫苗（PPV23），PPV23为多糖疫苗，不能诱发T细胞依赖的免疫反应，在2岁以内的幼儿不能诱发有效的免疫应答，因此主要用于65岁以上的老年人和2岁以上的高危人群。 七价肺炎球菌结合疫苗（PCV7）。PCV7是目前唯一的肺炎球菌结合疫苗，由七种常见致病血清型（4，6B，9V，14，18C，19
7、F，23F）荚膜多糖分别与白喉类毒素载体蛋白CRM197结合构成。肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白结合后能够诱发T细胞依赖的免疫反应，因此可以在2岁以内的幼儿产生有效的免疫应答，并且产生免疫记忆。这已经在PCV7的免疫原性研究中得到证实。,15,肺炎球菌疫苗,在美国进行的随机、双盲、对照研究中，共入选37830名健康儿童，结果显示对疫苗血清型IPD的有效性为97.4%i。 在美国纳入国家计划免疫后，至2003年，人群监测数据显示疫苗血清型IPD的发病率在5岁以下儿童中下降了94%ii。并且由于接种疫苗切断了肺炎球菌由儿童向成人的传播，使得50岁以上的成人疫苗血清型IPD的发病率下降了55%iii，产
8、生了群体免疫效果。 在加拿大、澳大利亚和西班牙等国家的人群监测结果也显示出类似的有效性。,16,肺炎球菌疫苗,PCV7对儿童肺炎和中耳炎的有效性也得到证实。临床研究显示，PCV7使1岁以内全部新发临床和放射确诊的肺炎下降32%i，疫苗血清型急性中耳炎下降57%ii。而在美国纳入计划免疫后，至2004年，使全部2岁以内因肺炎住院的病例减少39%iii；至2003年，使2岁以内儿童中耳炎就诊率下降20%iv。 PCV7还表现出控制肺炎球菌抗生素耐药的作用。美国人群监测数据显示，全部肺炎球菌青霉素耐药率从2000年的17.6%下降到2005年的9.9%i。PCV-7 疫苗已在世界各地进行过不同试验，
9、结果证明具有良好的安全性和耐受性.2006 年 WHO 的疫苗安全全球顾问委员会评估了 PCV-7 疫苗的安全性i,17,大纲,肺炎球菌疾病概况 肺炎球菌疫苗 肺炎球菌结合疫苗质量控制,18,种子批系统 用于制备多糖的生产菌株应该符合国家法规的规定，建立原始种子批、主种子批和工作种子批库。 每一菌株均应具有产生特定荚膜多糖的能力。应保存历史记录，包括获得来源和进行的所有鉴别实验。 肺炎球菌的培养物有以下特性：在显微镜下应该能够观察到培养物复染有典型的肺炎球菌特征，菌株在37C培养生长良好，而且应该有溶血性光滑型菌落；胆汁溶解度试验发现应该被溶解;而且对奥普托欣很敏感；荚膜膨胀反应阳性。可使用核
10、磁共振波谱法（1H或13C）来对提纯后的多糖进行鉴定。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,19,肺炎球菌生产用菌株 肺炎球菌荚膜多糖的生产是基于工作种子批（working seed lot）。工作种子批要和原始、主种子批具有相同的特征。 用于种子生产的培养基使用了来自动物的材料，则这些材料应该符合与生物医药品有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出的指导，而且应该得到国家管理机构的批准。应尽量避免采用动物来源的培养基。在菌种每一步扩增过程进行纯度检测及菌种鉴定。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,20,生产肺炎球菌多糖所使用的培养基: 疫苗生产所使用的液体培养基应该不含有会在提纯荚膜多糖时形成沉淀的成分。 应尽
11、量避免采用动物来源的培养基。如果使用了来自动物的材料，则应该符合与生物医药品有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出的指导，而且应该得到国家管理机构的批准。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,21,单次收获液 应该通过生长率、pH值和最终生产的多糖来验证肺炎球菌生长的一致性。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,22,肺炎球菌结合疫苗质量控制,肺炎球菌纯化 培养物在灭菌之前应该对培养液进行取样，并检查是否有微生物污染。应该使用适当的方法（包括接种到适当培养基中的方法）来验证培养物的纯度。如果发现有任何染污，则应该废弃该培养物或由其所得到的任何产品。杀菌工艺也应该进行充分验证。,23,肺炎球菌结合疫苗质量控制,多糖
12、的纯化 在灭菌之后，可收获培养物，可采用分级沉淀法、色谱法、酶处理法和超滤法等技术分离并提纯多糖。用来提纯多糖的方法应该得到国家药品管理机构的批准。为了确保稳定性，一般情况下将纯化的肺炎球菌多糖以及纯化的中间物在-20C以下保存。,24,肺炎球菌结合疫苗质量控制,肺炎球菌多糖的检测 鉴别试验：可采用对流免疫电泳法和适宜的方法 多糖的组分：从多糖的组成可以了解纯度，应该根据多糖的干重来进行分析。可以使用多种方法来确定多糖的组成，具体取决于所采用的分析方法以及多糖的具体类别。所使用的标准应该得到国家管理机构的批准。 水分含量：如果要以冻干粉形式来贮存纯化多糖，则要使用适当的检测方法来测定冻干粉的水
13、分含量，以便确定水分含量是否在所规定的范围之内。,25,蛋白杂质：采用Lowry等人所建立的方法或其它经过验证的方法来测定蛋白含量。应该使用足够多的多糖来进行分析，以便能够准确地检测到1%的蛋白杂质。每批纯多糖的蛋白百分含量一般来说不应该超过3%。但是，蛋白含量可能会随着血清型的不同而不同，合格的蛋白杂质含量应该与国家管理机构的规定相符。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,26,核酸杂质：使用紫外分光光度测定法进行测定时，所测得的每批多糖所含有的核酸不应该超过2%（重量百分含量）。 致热原含量：应该测定纯多糖的致热源含量，而且检测结果要在国家监督管理机构所规定的合格范围之内。可以对兔子进行公认的致热性
14、试验，也可以通过鲎变形细胞溶解物试验来测定致热性。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,27,肺炎球菌结合疫苗质量控制,分子大小分布可以根据每批产品的纯化多糖分子大小分布情况来确定生产工艺的一致性。可以通过工艺验证或检测每个批次来确定。通过测定多糖在洗脱曲线（使用适当的色谱分析法来获得洗脱曲线）主峰处的分子大小分布来测定分布常数（KD）。应该确定KD值和/或分子量分布范围。一般采用琼脂糖CL-4B或CL-6B凝胶过滤法或适宜的方法进行检测。应该对所使用的分析法和色谱柱进行验证，以便证实在适当的分子量范围之内具有足够分辨率。,28,载体蛋白的质控生产载体蛋白的微生物培养基应不含在人类致毒性或致过敏的物质。
15、种子批系统有历史记录并定期验证菌株特性。如果种子制备、保存或生产时使用了任何来自动物的原材料，则这些材料应该符合与生物医药品有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出的指导（31），而且应该得到国家监督管理机构的批准。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,29,载体蛋白的特性和纯度控制：许多蛋白可以用作肺炎球菌结合疫苗的载体。载体蛋白最重要的特性一是具有安全性，二是与多糖结合后可以诱发针对多糖抗原的T细胞依赖性的免疫反应。以常用的载体蛋白CRM197为例，在发酵和收获的过程中要进行纯度检测和菌种鉴定，来证实CRM197的抗原特性。进行ADP-核糖基化活性分析及其他分析方法（包括Hela细胞及Vera细胞分析
16、和豚鼠致死性分析）来检测CRM197的残基毒性。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,30,多糖与蛋白载体可通过多种方法进行结合。无论采用何种结合方法，都要建立质控程序来确保重复性、结合物的稳定性和安全性。应通过分析特定反应产物或其它方法来监测衍生和结合过程。结合过程采用的条件可能会导致不稳定基团的丢失，从而影响多糖链的结构。如果对单价原液的各种特性检测不能确认多糖链结构保持完整，应该进行多糖完整性的鉴定检测。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,31,应该对单价批量结合物的特性进行鉴定。鉴定方法需经过验证. 结合物提纯工序应该可以清除结合反应和封端反应的残余试剂。应该通过适当的检测或通过对提纯过程的验证来确认已
17、经将残余试剂和下述反应副产物清除：氰化物、1-乙烷基-3,3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺（EDAC）以及取决于化学结合反应的其它各种产物。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,32,肺炎球菌结合疫苗质量控制,多糖-蛋白比和结合标记物；对各血清型的每批结合物而言，多糖-载体蛋白比是结合化学反应的一致性标志。该比率应该在国家管理机构所批准的适用于此特定结合物的范围之内，而且应该和经临床试验验证有效的疫苗的比率一致。,33,对于肺炎球菌结合疫苗来说，该比率一般在0.3-3.0的范围之内，具体取决于血清型。该比率可以通过分别测定蛋白和多糖的含量来测定（进行未结合蛋白和未结合多糖的校正），也可以使用能够直接测
18、定该比率的方法来进行测定。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,34,封端标记物 （Capping marker）每批产品都不应含有活化的功能基团，无论是多糖的还是载体蛋白的。另外一个选择是通过监测封端反应的产物，或者验证封端反应过程来显示所有未反应的功能基团已经被去除。如果在疫苗研发期间，生产工艺已经得到验证，则不再需要在常规质控中进行这类分析。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,35,肺炎球菌结合疫苗质量控制,结合和未结合（游离）的多糖；只有与载体蛋白共价结合在一起的肺炎球菌多糖（即结合多糖）才是免疫学上对临床保护作用有重要意义的物质。每批纯化后的单价结合物应进行游离多糖检测，以保证其在国家管理机构所批准的
19、范围之内。下列方法可以在检测前分离未结合多糖，也可能适用于肺炎球炎多糖结合物：疏水色谱法、酸性沉淀法、使用载体特异性抗体进行的沉淀法、凝胶过滤法和超滤法。,36,蛋白含量结合物的蛋白含量应该在限定范围之内。应该对每批产品的结合蛋白和游离蛋白（unbound protein）进行检测。如可能，还应该测定未结合蛋白(unconjugated protein)的含量。测定结合蛋白和未结合蛋白可采用HPLC（高效液相色谱法）或毛细管电泳法。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,37,肺炎球菌结合疫苗质量控制,多糖-蛋白结合物的分子大小分布：多糖-蛋白结合物的分子大小对于确定生产一致性以及贮存稳定性来说，是一个非
20、常重要的参数。每批产品都应使用与结合物分子大小匹配的凝胶基质（matrix）来测定多糖-蛋白结合物的相对分子大小。检测方法应该进行验证，验证时要侧重于证实该方法有足够的特异性可以将多糖-蛋白结合物与其它可能存在的组份（如游离蛋白或多糖）区分开。分子大小标准各疫苗有所不同，应该与临床试验中证实有免疫原性的批次相一致。,38,无菌性：应该使用国家管理机构批准的方法来检测纯化后的结合物的无菌性（细菌和真菌）。如果产品中加入了某种防腐剂，则应该采取适当的措施来防止防腐剂对无菌性检测的干扰。 载体蛋白的特定毒性：必要时（如使用了破伤风或白喉类毒素）应该对单价批量结合物进行载体蛋白特定毒性检测。也可以通过
21、生产工艺的验证来证明载体蛋白没有特定毒性。 内毒素含量：为了确保最终产品中的内毒素在可接受范围，可以测定单价批量结合物的内毒素含量，检测结果要在国家管理机构所规定的范围之内。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,39,半成品原液（final bulk） 制备半成品原液，可将各型单价原液混合，在进行最终稀释之前加入佐剂、防腐剂和/或稳定剂。也可以各型单价原液分别与佐剂吸附，然后再混合成半成品原液。 无菌性 ：按照与单价原液同样的要求进行无菌性（细菌和真菌）检测。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,40,成品质控检测 特性鉴定：应该对成品进行鉴定，以证明成品包括了预计的所有肺炎球菌血清型多糖，但如果已经在半成品原液
22、中进行过此项检测的情况则不需要重复进行。可以通过血清学试验（使用对纯化多糖具有特异性的抗体）来进行检测。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,41,肺炎球菌结合疫苗质量控制,无菌性：按照与单价原液同样的要求进行无菌性（细菌和真菌）检测。 肺炎球菌多糖的含量：要检测最终包装成品的各型肺炎球菌多糖含量，检测结果要在国家管理机构所批准的范围之内。不同生产商所生产的结合疫苗配方不同。应该对最终包装成品的各型肺炎球菌多糖进行定量分析。不同产品使用的分析方法有所不同，包括色谱分析法或血清学检测法。也可以使用免疫学分析法来进行检测，如速率比浊法 或ELISA抑制法。,42,残余水分 ；如果为冻干制剂，则应该使用国家管
23、理机构所接受的分析方法来测定水分的平均含量。一般来说，残余水分的平均含量不得超过2.5%，而且单瓶疫苗的水分含量不得大于或等于3%。 内毒素含量 ；应该通过LAL（鲎变形细胞溶解物试验法, Limulus amoebocyte lysate）来检测最终包装中疫苗的内毒素含量。内毒素含量或致热活性应该与临床试验用疫苗的合格值相一致，而且应该得到国家管理机构的批准。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,43,佐剂含量:如果已经向疫苗中加入了某种佐剂，则应该使用国家管理机构批准的方法来检测其含量。佐剂的数量和性质应该与国家管理机构的规定相一致。如果将铝化合物当作佐剂来使用，则用于人时的每个单剂量的铝含量不得超
24、过1.25 mg。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,44,肺炎球菌结合疫苗质量控制,防腐剂含量 :生产商可以选择各种防腐剂。应该考虑到所选防腐剂的稳定性，还应该考虑各种疫苗组份和防腐剂之间可能出现的相互作用。如果已经向疫苗中加入了某种防腐剂，则应该使用国家管理机构批准的方法来测定防腐剂的含量。疫苗剂量中的防腐剂含量不应该对抗原有任何不良影响，而且也不应降低疫苗用于人体的安全性。防腐剂种类和浓度应该得到国家管理机构的批准。,45,一般安全性试验:各批肺炎球菌结合疫苗的意外毒性（异常毒性）的相关要求应该符合国家管理机构的规定。如果疫苗的一致性已经得到充分证实，并符合国家管理机构的要求，对于常规放行检测可以忽略此项目。,肺炎球菌结合疫苗质量控制,46,肺炎球菌结合疫苗质量控制,pH值:如果疫苗为液体制剂，则应该检测每批最终疫苗的pH值，而且检测结果要在临床试验和稳定性研究所用各批疫苗（已经证实具有安全性和有效性）的检测值的范围之内。对于冻干制剂来说，应该在使用适当稀释液进行复配之后测定pH值。 成品包装的检查:应该对每批成品进行目测检查，排除任何异常、破损以及有结块或颗粒物的产品。,47,谢谢！,
