1、,疟疾实验室检测技术培训2011年10月21日,疟疾全球分布,疟疾血检对象 “三热病人” 临床诊断为疟疾 疑似疟疾 不明原因发热病 非洲东南亚国家 等疟疾流行区入境人员和疟疾流行区回来发热人员为重点血检对象,一、疟疾实验室检测技术,目前，用于疟疾诊断的实验室检测包括病原学检查、免疫学检测和分子生物学检测等3类。（一）病原学检测检出疟疾的病原体疟原虫，是确诊的疟疾最直接证据。目前常用的有厚、薄血膜法，由于具有操作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等优点，病原学检测用于疟疾诊断已近一个世纪，且仍是目前最常用的方法之一。,血涂片制作 1.所需设备（1）载玻片：新载玻片应先浸入含洗涤剂的清水中1020分钟，
2、然后用干净棉毛巾逐片擦拭，再用清水冲洗干净，晒干，最后用干净柔软棉毛巾将玻片擦亮。最好将洗净的浸泡在 95%的酒精中510分钟，再将玻片擦干擦亮。,洗净的玻片每10 20张用干净的白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备有。（2）采血针：使用一次性采血针。（3）玻片盒：防污染、防苍蝇。（4）75酒精棉球：（5）记号笔：,2.采血的部位和方法以耳垂采血较为合适，也可在手指末端采血。先用75%酒精棉球消毒采血部位，待酒精干后，左手拇指和食指紧捏采血部位，右手持一次性采血针迅速刺入采血部位12mm深，然后用左手拇指和食指和右手中指协同挤出血滴。,3.涂制血膜取玻片2张，1张作载片，1张作推片用右手拇
3、指和食指夹持推片侧缘中部。用推片的左下角刮取血液4 5l，再用该端中部刮取血液1 1.5l。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.81cm的圆形厚血膜。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25 35角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。薄血膜长度约2.5cm为佳.,4.厚、薄血膜的位置 目前推荐使用一张载玻片只有1个厚血膜，1个薄血膜。,5. 染色前血膜的保存 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥
4、后才能染色。薄血膜在染色前须经甲醇固定，而厚血膜在染色前必须溶血，但新制作的厚血膜也可直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中12小时后取出血片。,(二) 血膜的染色1. 染色液的制备 目前常用的血膜染剂有吉氏和瑞氏两种。吉氏染液染色效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。瑞氏染色法因操作简便，常用于个别血片
5、染色。,(1)吉氏染液：吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。,(2)瑞氏染液瑞氏染剂粉1g， 甲醇500ml， 甘油15ml。将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，倒入有玻塞瓶中，再用甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。,2. 染色用水中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，
6、pH7.07.2水效果最佳。可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。配制pH6.67.4缓冲液时，先制备好两种贮备液。贮备液1为每1000ml蒸馏水含9.5g 磷酸氢二钠，贮备液为每1000ml蒸馏水含9.07g 磷酸二氢钾。配制pH6.67.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。3. 染色方法除瑞氏染色法外，染色前薄血膜要用甲醇或无水乙醇固定，厚血膜用蒸馏水或清水溶血。,(1)吉氏染色法成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或背靠背插入染色缸中，倒入新配的2吉氏染液(2ml吉氏原液同98ml蒸馏水或缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸
7、中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗23次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。,单张血膜染色可取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏染液1滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色2030分钟，然后水洗、晾干。染薄血膜时，染液浓度可稍高、时间稍长一些，而染厚血膜时，则染液浓度可稍低、时间稍短一些。当同一张玻片上厚血膜与薄血膜同时染色时，应按照厚血膜的染色方法，以免厚血膜过染而镜检困难。,(2)瑞氏染色法在薄血膜上滴加67滴瑞氏染液，轻轻摇动玻片，使染液在血膜上展开30秒钟，加蒸馏水或缓冲液1012滴，摇动玻片，使染液与水充分混合，并将染液引
8、到厚血膜上，使厚薄血膜同时染色5分钟，然后用蒸馏水或缓冲液将血膜冲洗干净，晾干后检查。,4. 影响血膜染色质量的因素 血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关:(1) 染料和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察染色是否理想，否则需重新制备染液。,(2) 染液的新旧：新配制的染液，一般染色力较弱，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前12周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影
9、响染液质量。(3) 染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果。,(4) 染色时间：染色时间长，染色效果好，反之则差。染色时间长短与温度有关，温度高着色快，故染色时间可适当缩短，温度低染色慢，则时间可适当延长。所以染色时间长短要随着染液的质量、新旧、浓度及温度而决定。(5) 稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.07.2的水稀释。当染色太蓝，可
10、用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。(6) 冲洗方法：染色后不要直接将染液倒掉，应将玻片连同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。,（三）注意事项1、采血时间 在临床诊断疟疾患者时，应考虑在什么时候取血较为适宜，尤在确定不下虫种和查不到疟原虫的疑似疟疾患者的情况下极为重要。,（1）间日疟原虫在患者刚发冷发热以后，大部是在环状滋养体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。虽在般情况下，任何时间检查感染者的末稍血液，多少能查到各个时期的原虫。一般是在患者发作数小时至十余小时
11、，即滋养体已经发育至具有易于鉴别的晚期滋养体期。,（2）恶性疟原虫从理论上说，因为恶性原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末稍血液中不易查到。但实际情况不尽如此，一般在受染者的末稍血液中，随时能见到少数恶性疟原虫的环状滋养体，较理想的取血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状滋养体虽已发育至最高峰，但尚未回至内脏的毛细血管中去进行裂体生殖。环状体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴别。恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时，一般需要在发作八日后才能在末稍血液中出现，应当注意。,2.编号编号可根据实际操作进行。号码必须不易脱落，最好是血片自然干燥后用铅笔在薄
12、血膜上编号，并表明姓名、日期。3.血片制作4.制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置之标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱除。5.血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细 胞沉在一边，可使厚薄不匀。6.防止苍蝇吮吸血膜和灰尘污染血片。,人体疟原虫的基本构造,2. 核 即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗红或紫红色。3. 疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色；三日疟原虫的色素呈
13、砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。,被寄生的红细胞 被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。疟原虫发育至阿米巴样体，红细胞出现薛氏点(Schuffners dots)。 被恶性疟原虫寄生的红细胞大小正常或稍微缩小，红细胞上有时见到茂氏点(Maurers dots)。,疟原虫胞浆,疟原虫核,Plasmodium vivax,环状体期,Plasmodium vivax,大滋养体期,早期裂殖体期,核,胞浆,色素,空泡,间日疟早期滋养体-环状体,约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。,间日疟滋养体-大滋养体,红
14、细胞：胀大褪色，出现形状大小相等，分布均 匀，数目较多，鲜红色薛氏小点。 大小：较大。 胞浆：不规则，浅兰色，出现阿米巴伪足，有空泡。 核： 红色，一个。 色素：细小杆状，黄褐色，分布不均匀。,薄血膜形态小滋养体,大滋养体,间日疟裂殖体,经40小时晚期滋养体发育成熟，虫体变圆，空泡消失 核开始分裂又称裂殖体前期 色素聚集成团块,红细胞：胀大，褪色，可见薛氏小点。 大小： 个体较大。 胞浆和核：裂殖子12-24个平均16个，排列不规则，核红色，胞浆浅兰色。 色素： 黄褐色常集于疟原虫的一 边。,间日疟成熟裂殖体,间日疟原虫雄(小）配子体,虫体较大，占满胀大的红细胞 胞质致密，色深蓝 核小致密，深
15、红色，多位于虫体一侧 疟色素分散,间日疟原虫雌（大）配子体,虫体较小，占满胀大的红细胞 胞质浅蓝 褐核大疏松，淡红色，多位于虫体的中央。 疟色素分散,间日疟雌配子体和大滋养体的形态,间日疟雌配子体与大滋养体区别,虫体大小:几乎充满被寄生的红细胞 核: 一个，较大且致密，周围 有一圈空白的不染色带 胞浆: 边缘清楚，不含空泡 疟色素: 颗粒较多较粗，均匀散在,虫体大小:不超过被寄生红细胞的3/4 核: 一个，延长呈带状，周围无明显的不染色带 胞浆: 边缘不整齐，多有空泡 疟色素: 颗粒较少较细，分布不均匀,Plasmodium vivax,雄配子体,雌配子体,核,胞浆,色素,Plasmodium
16、 falciparum,环状体期,核,胞浆,1个红细胞内2、3个原虫,Plasmodium falciparum,大滋养体,成熟裂殖体,核,胞浆,色素,红细胞茂氏点,Plasmodium falciparum,雌配子体,雄配子体,恶性疟原虫-环状体,环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大 可见数粒，大小不一，红色粗大的茂氏点 核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫 虫体常位于红细胞的边缘 ，呈“鸟飞状” 不带色素,恶性疟原虫大滋养体,红细胞：大小正常，颜色较深， 可出现较粗、大小不一、分布不匀、数目较少红色茂氏小点。 大小： 较小。 胞浆： 兰色，圆形，坚实，体积小。 核： 一个，红
17、色。 色素： 较细的黑褐色颗粒，常集成块。一般不出现在外周血中,恶性疟原虫成熟裂殖体,裂殖子836个，通常1824个，排列不规则 疟色素集中成一团 虫体占红细胞体积的2/3至3/4,恶性疟原虫雌配子体,形状大小：新月形，两端稍尖。 胞浆： 深兰色。 核： 一个，较小，致密，深红色位于中央，核周可见透明不染色带。 色素：黑褐色，密布于核的周围,恶性疟原虫雄配子体,腊肠形，两端钝圆 胞质色蓝而略带红 核疏松，淡红色，位于中央 疟色素黑褐色，小杆状，在核周围较多,雌配子体,雄配子体,寄生的红细胞经染色后，因细胞内血红蛋白溶解，轮廓消失，但有时尚留下残骸的“影子”或点彩。 厚血膜由于用血量多，血膜小，
18、细胞重迭，干燥缓慢，各期疟原虫的体积都略为缩小，其中大、小滋养体的形态有较大改变，而裂殖体和配子体的形态则无明显变化。小滋养体 胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。间日疟原虫的环较大，常呈分号“；”和感叹号“！”状；而恶性疟原虫的环纤细，常呈分号“：”、飞鸟“.”、V状和断环状。,疟原虫厚血膜形态变异,间日疟原虫小滋养体胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。间日疟原虫的环较大，常呈分号“；”和感叹号“！”状。,Pv.,Pf.,而恶性疟原虫的环纤细，常呈分号“：”、飞鸟“.”、V状和断环状。,厚薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为1-1.5l，
19、涂制成2cm宽2.5cm长面积的薄血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，便于疟原虫虫种的鉴定。由于用血量少，因而极有可能出现漏诊，不适用于大规模调查。,厚血膜用血量约为4l5l。涂制成直径1cm的厚血膜由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。受影响较大的有大滋养体、裂殖体的形态，不利于虫种鉴别。,由于厚血膜与薄血膜相比血量大，镜检范围小，节省时间，阳性检出率较高。 厚血膜能检出疟原虫数是薄血膜的1525倍。所以，疟疾诊断应以检查厚血膜为主。在普查时均应查完整个厚血膜，未查见疟原虫则判为阴性。,厚血
20、膜中二种人体疟原虫从主要鉴别要点,被寄生红细胞形态,（二）免疫学检测疟疾的免疫学检测包括检测抗体和检测抗原两种方法。前者主要用于评估疟疾的传播强度和地方性流行水平等流行病学调查和监测。由于在疟原虫廓清后的相当长时间内，抗疟原虫抗体在患者外周血中依然存在，因而不能单纯根据检出抗体而确诊为疟疾现症患者。检测患者血样或其他样品中的疟原虫抗原则有助于确诊疟疾。,1疟原虫抗体的检测 目前用得较多的是IFA。感染动物或体外培养等途径获取疟原虫，在玻片上制成亚厚血膜作为抗原，经与血清/血浆中相应的抗疟原虫抗体结合，再用异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人
21、免疫球蛋白抗体与之结合，即可在荧光显微镜下观察结果。由于体外培养恶性疟原虫获得成功，为IFA所用的抗原片，提供了丰富的抗原来源。由于目前尚不能连续体外培养间日疟原虫，因而在对间日疟患者进行IFA时，常用异种抗原替代间日疟原虫抗原以检测抗间日疟原虫抗体，最常用者为食蟹猴疟原虫抗原。疟疾患者在经适当治疗、外周血中原虫被廓清后，抗疟原虫抗体仍可在患者体内存留相当长时间。治愈后1个月，有95%的患者可检出抗体；即使在治愈后15个月，尚有约五分之一的患者可检出抗体。,2疟原虫抗原的检测 目前有ICT和OptiMAL等试剂盒，有单纯恶性疟诊断卡和恶性疟、间日疟双虫诊断试剂盒（ICT Malaria Com
22、b Cassette Test),五、疟疾研究新进展,（一）疟疾疫苗RTS,S非洲小范围临床试验成功西班牙科学家近日在莫桑比克进行的一项小范围临床试验获得成功，证明RTS,S疫苗能够有效帮助婴儿抵御疟疾。这一结果为将在数千名非洲儿童身上进行的、针对该疫苗的大规模临床测试奠定了良好的基础。相关论文10月17日在线发表于柳叶刀（The Lancet）。,RTS,S疫苗由比利时葛兰素史克生物制品有限公司（GSK）研制成功，它能为人体提供针对疟疾寄生虫的双重保护。第一重，它能刺激人体产生抗体以攻击进入血液的寄生虫；第二重，它能促进免疫系统T细胞的产生，用来杀灭进入肝脏的寄生虫。 在最新的试验中，西班牙
23、巴塞罗那大学的热带病专家Pedro Alonso和同事，对94个莫桑比克乡下婴儿在10周、14周及18周大时分别注射了RTS,S，并与控制组进行比较。结果发现，注射了RTS,S的婴儿患疟疾的几率比控制组婴儿要低65%，且副作用并不比普通接种疫苗多。 按照计划，三期临床试验将于明年晚些时候启动。试验对象将包括非洲七国的1.6万名儿童。如果一切顺利的话，GSK表示将于2011年申请许可证。,（二）疟原虫基因组序列测定一个由美英等国科学家组成的国际研究小组近日测定了两种致命疟疾寄生虫的基因组序列。这两种疟疾寄生虫分别名为Plasmodium knowlesi和Plasmodium vivax，其中P
24、. knowlesi最近被认为是感染人类的一个主要疟疾病原体，而P. vivax则会致人极度虚弱，甚至死亡。 相关论文发表在10月9日的自然（Nature）杂志上。,（三）疟疾快速诊断,ICT快速诊断卡是疟疾快速免疫色谱诊断试验卡。有单纯恶性疟诊断卡和恶性疟、间日疟双虫诊断卡两种。目前此产品已在全球疟疾流行区得到应用。,疟疾快速试纸条,OptiMAL疟疾快速试纸条美国Flow Incorporated公司生产OptiMAL疟疾快速诊断试纸条检测间日疟的敏感度为59%（95%CI:0.47540.6983），特异度为95%（95%CI:0.92680.97）;检测恶性疟的敏感度为60%（95%CI:0.23070.8824），特异度为99%（95%CI:0.98030.9985）。出现1例间日疟交叉反应。,（四）疟原虫基因检测技术在疟疾诊断中的应用 疟原虫基因检测技术在疟疾监测中的应用范围，与常规的疟原虫显微镜血片检查和新发展的疟疾快速免疫诊断试条相比，疟原虫基因检测技术有其特殊的技术特点。具有高度敏感性、高度特异性、但需要较高的实验条件和技术。,（五）耐药性研究,2009年2月25日世界卫生组织宣布，泰柬边界地区出现的对青蒿素具有耐药性的疟原虫，可能会严重影响全球疟疾防治工作成果。比尔和梅琳达盖茨基金会捐助的2250万美元将遏制耐青蒿素疟原虫的研究。,谢谢！,
