1、1微专题突破 无菌操作技术实践一、微生物的分离与鉴定微生物的分离方法有很多种，本专题中常用的是：平板划线法、涂抹平板法、微生物的选择培养等。针对不同微生物的特点选择不同的方法，对目的微生物进行筛选。以下是尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定比较。项目 尿素分解菌的分离与鉴定 纤维素分解菌的分离与鉴定分离选择条件利用尿素为唯一氮源 利用纤维素为唯一碳源鉴定方法培养基中加入酚红指示剂，变红色在以纤维素为唯一碳源的培养基上，利用刚果红染色法，出现透明圈鉴定原理细菌等微生物合成脲酶，将尿素分解产生 NH3，使 pH 升高，加入酚红变红色分解纤维素的微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使
2、纤维素刚果红复合物降解而出现透明圈步骤土壤取样制备培养基样品梯度稀释涂布平板培养观察进一步鉴定土壤取样制备培养基选择培养富集培养梯度稀释涂布培养刚果红染色法挑取菌落进一步鉴定二、纯化细菌的方法1倒平板与涂布平板法的操作(1)倒平板操作(2)涂布平板操作22两种纯化细菌的方法比较项目 优点 缺点 适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥，效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌三、影响植物组织培养过程的几种主要因素1培养材料不同的植物组织，培养的难易程度差别很大，容易进行无性繁殖的植物也容易进
3、行组织培养。同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短对培养也有影响。幼龄、保存时间短的植物材料容易培养成功。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。2无菌条件培养基上有细菌等微生物存在时，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此在培养过程中要求进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。3植物激素在配制好的 MS 培养基中，常常需要添加植物激素。其中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，都会影响实验结果。31在进行分离分解尿素的细菌的实验时，甲同学从培养基上筛选
4、出大约 150 个菌落，而其他同学只筛选出大约 50 个菌落。某同学的实验结果产生的原因可能有( )土样不同 培养基污染 操作失误 没有设置对照A BC D【解析】 某同学从培养基上筛选出的菌落较多，存在多种原因，如土样不同、培养基可能被杂菌污染或操作过程失误混入杂菌造成污染等。【答案】 A2下列有关平板划线操作的说法正确的是( )A使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放入培养箱中培养【解析】 在培养基上接种时，一定要做到无菌操作，以防止杂菌污染影响实验
5、或研究的结果。在酒精灯火焰附近约 10 cm 的四周为无菌区，因而含菌种试管和待接种试管管口不能离开火焰附近，接种环、棉塞也不能离开火焰附近。接种完毕之后为了防止菌体污染，保证安全，要用火焰灼烧管口和接种环，立即盖上皿盖。为防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，应将平板倒置。【答案】 D3菊花的组织培养需要严格的无菌操作，下列说法不正确的是( ) 【导学号：67850018】A培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌B幼苗要先移植到消过毒的蛭石或者珍珠岩等环境下生活一段时间C用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，一旦感染杂菌则前功尽弃D将菊花茎段插入时应注意方向，不应倒插，是为了防止
6、杂菌污染【解析】 植物的组织培养需要严格的无菌操作，将菊花茎段插入时，不应倒插是因为倒插的茎段不能形成愈伤组织，而不是为了防止杂菌污染。【答案】 D4美国科学家斯图尔德应用植物组织培养技术，将二倍体胡萝卜韧皮部的一些细胞进行离体培养，最终发育成完整的新植株(如图)。关于这一 科学事实，下列叙述中错误的是( ) 【导学号：67850019】4A该实验证明了植物细胞具有全能性B在此过程必须确保无菌操作C韧皮部细胞通过减数分裂增加数目D此种生殖产生的后代能保持亲本的性状【解析】 该实验是利用胡萝卜的体细胞发育成完整的植株，因此体现了植物细胞的全能性；植物组织培养技术是一种无性繁殖方式，因此后代能保持
7、亲本的性状；韧皮部细胞属于体细胞，体细胞依靠有丝分裂增加细胞的数目。【答案】 C5某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物 A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物 A 的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示，请分析回答下列问题：(1)培养基中加入化合物 A 的目的是_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_。(3)在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是_。(4)转为固体培养基时，常采用平板划线法进行接种，此过程中所用的接种工具是_
8、，操作时采用_灭菌的方法。(5)如何确认培养基是否合格？_。【解析】 欲筛选可降解有机物 A 的微生物，需配制只以有机物 A 为唯一碳源的选择培养基，以保障目的菌的生长，抑制非目的菌的生长繁殖；若需“振荡”培养，表明该目的菌为好氧型；平板划线接种的工具为接种环，使用前后均需灼烧灭菌。【答案】 (1)筛选目的菌 选择 (2)化合物 A 异养需氧型 (3)防止外来杂菌污染 (4)接种环 灼烧 (5)不接种的空白培养基与接种培养基一起培养，用以证明培养基制备过程中是否被杂菌污染5章末综合测评(一)(时间：45 分钟，分值：100 分)一、选择题(共 8 小题，每小题 5 分，共 40 分)1对无菌操
9、作转接培养物的叙述中，正确的是( )接种环在火焰上灼烧灭菌在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞打开棉塞的试管口通过火焰将已冷却的接种环伸入菌液，蘸取一环菌液转移到一装有无菌培养基的试管中将试管口塞上棉塞接种环进行灭菌A BC D【解析】 在无菌操作转接培养物的过程中，刚开始应灼烧接种环进行灭菌，在操作过程中应在酒精灯火焰旁进行，转接完成后还应对接种环进行灭菌，以防止培养物扩散到环境中。【答案】 C2在农田土壤的表层自生固氮菌较多。将用表层土制成的稀泥浆接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其他细菌分开，对培养基的要求是( )加抗生素 不加抗生素 加氮素 不加氮素 加葡萄糖 不加葡萄糖 37 恒温
10、箱中培养 2830 温度下培养A BC D【解析】 自生固氮菌有固氮功能，因此培养基中不需要加氮素；细菌对抗生素敏感，因此，不能加抗生素；自生固氮菌是异养型的，应加葡萄糖；其生长繁殖的适宜温度是2830 。【答案】 C3关于用涂布平板法培养和计数土壤中仅以尿素为氮源的微生物的实验，以下操作不正确的是( )A需制备系列浓度梯度的土壤悬液B所选用的培养基中，尿素为唯一氮源C接种时从浓度最低的土壤悬液开始，每个浓度设置 3 个重复D涂布平板上形成的每个菌落，都是由样品中的单个个体形成的【解析】 由于待测样品往往不易完全分散成单个个体，长成的菌落，也有可能来源6于样品中的 23 个或更多个个体。【答案
11、】 D4某学者欲研究被石油污染过的土壤中的细菌数并从中筛选出能分解石油的细菌。下列有关操作错误的是( ) 【导学号：67850020】A利用平板划线法对细菌进行计数B利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌C采用涂布平板法分离菌种D称取土壤和稀释土壤溶液时应在火焰旁操作【解析】 平板划线法能对细菌分离纯化但不能计数，通常将被石油污染过的土壤浸出液稀释后，采用涂布平板法分离分解石油的细菌菌种，并对菌种进行计数；筛选能分解石油的细菌只能利用以石油为唯一碳源的选择培养基；称取土壤和稀释土壤溶液过程中的每一步都要在火焰旁操作。【答案】 A5下面为植物组织培养过程的示意图：对上图的下列叙述，错误
12、的是( )A将经脱分化培养成时，再植上人造种皮即可获得人造种子B植物组织培养所依据的生物学原理为细胞的全能性C过程指植物的营养生长和生殖生长阶段D的再分化过程中，诱导生根的激素为生长素【解析】 人工种子是由通过植物组织培养将离体的植物组织培养成的具有生根发芽能力的胚状结构包裹上人造种皮制成的，而不是由愈伤组织包上人造种皮形成的。【答案】 A6用高度分化的植物器官、组织或细胞进行组织培养可以形成愈伤组织。下列叙述不正确的是( )A该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B该愈伤组织的细胞没有全能性C该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成的D该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构【解析】 植物组
13、织培养的原理是植物细胞的全能性。植物细胞只有在脱离了植物体，在一定的外部因素的作用下，细胞经脱分化和分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织分化形成胚状体或丛芽，从而形成新的植物体。7【答案】 B7甲、乙、丙是三种微生物，下表、是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在中正常生长繁殖；甲能在中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在中正常生长繁殖，而甲和丙都不能。下列说法正确的是( )培养基粉状硫 10 gK2HPO44 gFeSO405 g蔗糖10 g(NH4)2SO404 gH2O100 mLMgSO4925 gCaCl205 g 注：“”表示培养基中加入了这种物质， “”表示培养基
14、中没有加入这种物质。A甲、乙、丙都是异养型微生物B甲、乙都是自养型微生物，丙是异养型微生物C甲是异养型微生物、乙是固氮微生物、丙是自养型微生物D甲是固氮微生物、乙是自养型微生物，丙是异养型微生物【解析】 中缺少 N，中缺少有机物，中营养全面。N 是微生物生长的必需元素，每一种微生物正常生长都需要 N，但自己能够固氮的微生物可以生活在无氮培养基中。甲能在中生长繁殖，而乙，丙都不以，说明甲是能够固氮的微生物。乙能在中生长繁殖，而甲、丙不能，说明乙不需要培养基为它的正常生命活动提供能源物质，则乙为自养型微生物，甲、丙都为异养型微生物。【答案】 D8抗生素可由微生物产生，具有抑菌作用，能在琼脂培养基中
15、扩散。在筛选产生抗生素的菌种时，先在琼脂培养基平板上划线接种一种从土壤中获得的甲菌，在 27 下培养 3 d，形成菌落。然后接种乙、丙、丁三种致病菌(如下图 a)，继续在同样条件下培养 3 d，结果如下图 b。分析结果，得出的结论是( )a b甲菌产生了抗生素丁菌的生长被丙菌产生的抗生素抑制乙菌的生长被甲菌产生的抗生素抑制丙菌产生的抗生素抑制了乙菌的生长8A BC D【解析】 由图可得出，乙、丙、丁三种致病菌不会产生抗生素，否则靠近乙、丙、丁的甲菌落不能生长。从图 b 来看，乙菌的生长被抑制，最可能的原因是甲菌产生了抗生素，此种抗生素只能抑制乙菌的生长，而对丙、丁两种致病菌没有影响。【答案】
16、A二、非选择题(共 60 分)9(10 分)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于_培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即_和_。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力_。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和_。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。【解析】 (1)可以将
17、所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，能降解原油的细菌才能在只含原油这一碳源的培养基上生存。(2)分离纯化菌种时，接种的方法有平板划线法和涂布平板法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。(3)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌(如接种环)、干热灭菌(如培养皿)和高压蒸汽灭菌(如培养基)等。无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生
18、物的污染。【答案】 (1)原油 选择 (2)平板划线法 涂布平板法 (3)强 (4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰10(16 分)将基因型为 AaBb 的水稻(具有 24 条染色体)的叶肉细胞通过无菌操作接入含有营养成分全面的培养基的试管中，在一定条件下培养形成试管幼苗，其过程如下图所示： 【导学号：67850021】9(1)图中的1过程为_，图中的2过程为_。(2)在形成愈伤组织的过程中，细胞必须不断地从培养基中获得_、_和小分子有机物等营养物质。(3)如果4是无病毒植株，则“水稻的某种细胞”应选用_或_细胞，这种繁殖方式实际上是_，培养成的植株的基因型为_。(4)如果某种细胞选用的是水稻花粉
19、细胞，则4称为_植株，基因型可能是_，植株特点为_，需用_处理，使其恢复正常体细胞染色体数，对应的基因型为_。【解析】 (1)植物组织培养的基本过程为：外植体 愈伤组织 根、芽 脱 分 化 再 分 化 植物体。(2)在形成愈伤组织的过程中，细胞不能进行光合作用，必须从培养基中获取水、无机盐和小分子有机物等营养物质。(3)根尖或茎尖细胞不含病毒，因此可用根尖或茎尖通过植物组织培养技术获得脱毒植株，这种繁殖方式属于无性生殖，其培养成的新植株的基因型与母本一致。(4)该水稻的基因型为 AaBb，可产生四种花粉：AB、Ab、aB、ab，通过花药离体培养可获得四种基因型的单倍体植株：AB、Ab、aB、a
20、b。单倍体植株长得弱小，且高度不育，用秋水仙素处理后使其染色体加倍后获得可育植株，对应的基因型有AABB、AAbb、aaBB、aabb。【答案】 (1)脱分化 再分化 (2)水分 无机盐 (3)茎尖 根尖 无性生殖 AaBb (4)单倍体 aB、ab、Ab、AB 植株弱小，高度不育 秋水仙素 aaBB、aabb、AAbb、AABB11(18 分)(2016全国丙卷)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用_对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是_。
21、(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_和_。分离纯化时应挑选出_的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在20 长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。【解析】 (1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。(2)乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别10和分离。(3)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3 mL 的甘油瓶
22、中，装入 1 mL 甘油后灭菌。将 1 mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20 的冷冻箱中保存。【答案】 (1)无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落 (2)鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸(或酸) 具有透明圈 (3)甘油12(16 分)耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了能高效产生耐高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示：(1)从用途上来说，号培养基属于_培养基，仅以淀粉作为_源；从物理状态上来说，号培养基属于固体培养基，配制时一般加入_作为凝固剂。(2)进行过程的目的是_；过程所使用的接种方法是_法。(3)、号培养基配制和灭菌
23、时，灭菌与调节 pH 的先后顺序是_；一般对配制的培养基采用_法灭菌。(4)部分嗜热菌在号培养基上生长时可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，应挑出透明圈_(填“大”或“小”)的菌落，接种到号培养基上。(5)下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。获得图 A 效果的接种方法是_，获得图 B 效果的接种方法是_。一同学用涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是_，应当怎样操作才可避免此现象？_。【解析】 (1)筛选特定微生物的培养基属于选择培养基。淀粉酶能催化淀粉分解，故筛选能高效产生高温淀粉酶的嗜热菌要以淀粉为唯一碳源。采用平板划线法接种的是固体培养基，通常用琼脂作为凝固剂。(2)、过程为将样品稀释后用涂布平板法接种。(3)制备培养基时先调 pH 后灭菌，培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。(4)嗜热菌可产生淀粉酶以分解培养基中的淀粉，在菌落周围出现透明圈，透明圈越大，说明该嗜热菌分解淀粉的能力越强。(5)纯化培养中接种方法有平板划线法和涂布平板法，前一种方法形成的菌落分布较均匀，后一种方法形成的菌落分布不均匀，先划线的部分菌落密集甚至相连，后划线的部分菌落分布稀疏。涂布平板时如菌液浓度过高会导致培养基上菌落连成一片，无法分离，操作时应适当增大稀释倍数。
