1、绪 论,检验教研窒,1903年美国宾西法尼亚州立医院成立了第一个专门的临床检验实验室1931 年，恩斯特 鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。1950年美国学者Levey和Jennings发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉开序幕，该方法至今仍被各临床实验室所使用。,国外医学检验学发展简史,19世纪70年代，德国学者Koch创造固体培养基，将细菌从环境或病人排泄物等标本中分离成单一菌落1959放射免疫分析技术及1975年单克隆抗体技术的创立均获得诺贝尔生物医学奖。1985年美国PECetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时
2、代意义的聚合酶链反应技术,国外医学检验学发展简史,新中国成立时，检验专业技术人员4000余人 1979年9月成立了中华医学会检验分会，并在WHO的支持指导下，同年成立了卫生部临床检验中心,国内医学检验学发展简史,70年代我国参加了世界卫生组织的临床化学质量评价活动 1991年我国卫生部部长令：首批淘汰三十五项检验项目1990年后，一些高科技、分子生物学技术在检验医学方面应用迅速增多2000年中华医学检验杂志正式更名为中华检验医学杂志，检验医学作为一个学科名称正式确立。,国内医学检验学发展简史,clinical laboratory technology or science,临 床 检 验,通
3、过实验室的各种检查方法，包括感官检查、理学检查、化学检查、显微镜检查以及自动化仪器检查等，对病人的血液、体液、分泌物和排泄物等标本进行检查、分析，以获得病原、病理变化及脏器功能状态等资料。,医院检验科,临 检 室,生 化 室,免 疫 室,血 液 室,基 因 室,微 生 物 室,病 理 室,从手工检测进行仪器自动化检测 检验试剂批量化、专业化、多样化 检验方法标准化 实施了全面的质量管理和保证 床旁检测（point of care test ,POCT）,医学检验学的现状,临床检验基础的临床应用,1、为准确诊断、及时治疗提供依据,临床检验的结果是支持诊断、鉴别诊断、甚至确定诊断的主要依据,例：a
4、nemia,依据：血中红细胞和血红蛋白量减少,leukemia,依据：血象和骨髓象变化,肾脏有实质性损伤依据,尿液中出现蛋白、细胞、管型,tumor？,2、为分析病情、观察疗效、判断预后提供依据,在疾病过程中，血液、体液、分泌物和排泄物也会随之发生相应的变化,3、为预防疾病提供资料,如血象和肿瘤细胞学的普查等,临床检验的临床应用,4、为科学研究提供医学检验数据,目视检查: 直接观察标本：颜色、透明度、性状，有无凝块或寄生虫 理学检查: 液体的相对密度、血液比粘度、红细胞沉降率、红细胞比积等病理变化,临床检验的一般方法（1）,化学检查: 定性和定量检测标本化学成分的病理变化 显微镜检查: 观察有
5、型成分的数量和形态 自动化仪器检查: 电子技术、程序控制的发展,临床检验的一般方法（2）,理论联系实践实验技能和方法学评价检验结果参考值及临床意义检验工作者的医德,学习临床检验的基本要求,thanks,血液标本的采集,一、血液生理,血液的组成 血液的理化特性 血液的功能,血液,血 浆,血 细 胞,红细胞 白细胞 血小板,水：9092,血浆蛋白,溶质： 810,小分子物质,营养物质 激素 代谢产物,有机物,无机盐（电解质）,白蛋白 球蛋白 纤维蛋白原,血液的组成及血浆成分,血液的功能,1 营养 2 运输 3 缓冲 4 参与机体免疫参与凝血和抗凝,二、血液标本的采集,全 血 静脉全血：G-6-PD
6、、糖化血红蛋白、基因检测 动脉全血：血气分析 末稍全血：用于细胞计数、分类、形态观察,分 类,血浆：全血去除血细胞,用于血栓止血检测 血清：全血自然凝固后析出的液体,用于生物化学、免疫学检测等,分 类,采血用品,1、皮肤采血法：微量检测 (the collection of capillary blood) 采血部位：耳垂或手指末梢,血液标本采集的方法,2、静脉采血法 (the collection of venous blood) 用于血沉、免疫、生化等检测项目部位：以肘部静脉为主,采集方法,注血标本法,采血的注意事项,真空采血管颜色及应用,多管血分配顺序,黄 色,红 色,紫 色,黑 色,绿
7、 色,浅蓝色,动脉采血法,通常选用桡动脉（方便）、股动脉、肱动脉,标本采集时应规范操作，以减少误差 毛细血管采血时应避开伤损部位，避免挤压皮肤，血液应自然流出 静脉采血时压脉带压迫时间不宜太长 动脉采血后应立即与空气隔绝，阻止血气交换,标本采集的注意事项,注意：严禁在静脉输液管中采集血液,两种采血方法的应用,皮肤采血法,静脉采血法,缺点,限制了重复实验和追 加实验，标本量少， 局部炎症可得假结果 ，组织液可混入,不同抗凝剂的使用， 改变血液性质，影响 有形成分的形态,优点,价廉、快速、操作简 便，标本可直接测定,标本代表性大，无组 织液影响，适于临床 研究，可重复实验和 追加其他实验,标本送检
8、、保存与处理,唯一标识、生物安全原则、尽快运送 接收与拒收标本原则; 未检测标本的保存、检测后标本析保存 检验后血液标本的处理,抗凝剂的选择和运用,抗凝 用物理或化学方法除去或抑制血 液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固，称为抗凝。 抗凝剂 钙拮抗剂、肝素。,概念,抗凝原理：形成草酸钙沉淀 使用方法：草酸钠0.1mol/L和血液1:9 优点：溶解性好，价廉 缺点：对凝血因子保护功能差，影响凝血因子；形成草酸钙沉淀物，影响自动凝血仪器的使用 使用范围：双草酸盐维持红细胞体积，使血小板聚集、白细胞形态改变,草酸盐,抗凝原理：与钙离子生成可溶性的鳌合物 使用方法：配成109 mmol/L的浓度和
9、血液1:9,106 mmol/L的浓度和血液1:4 优点：对凝血因子有很好的保护作用 缺点：血液中溶解度低，抗凝作用较弱 使用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）,枸橼酸钠,抗凝原理：生成可溶性的鳌合物。 使用方法：15g/L EDTA和血液1:10。 优点：对红细胞和白细胞形态影响小。 缺点：影响血小板的聚集。 使用范围：全血细胞分析和血细胞比容测定，不适用于出凝血实验和血小板功能,乙二胺四乙酸（EDTA）盐,抗凝原理：加强抗凝血酶作用 使用方法：肝素钠1g/L与血液1:10 优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温 缺点：引起白细胞聚集，使白细胞计数降低，不利于制备血
10、涂片，价格昂贵 使用范围：红细胞脆性实验，科学研究等,肝素,谢 谢,血涂片的用途： 血细胞形态学检验 网织红 异常寄生虫检验,四、血涂片 血涂片的制备技术,涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。,实验原理,1采血 2制作涂片 3干燥涂片 4标记涂片 5染色6观察结果,血涂片制备步骤(手工推片法),医用一次性采血针 酒精棉球 镊子 经脱脂洗净的载玻片 双凹片（推片）,实验器材准备,采血前用70酒精棉球消毒人的指腹,采 血,由于第一滴血中含单核白细胞较多，因此弃去第一滴血,推片：挤出第二滴血置于
11、载玻片的右侧,再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。,3045,两玻片的角度以3045为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。,将推玻片向后稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向前方滑动。,血涂片的制作,均匀 厚薄 头体尾 边缘 两侧,血涂片质量评价,注意： 血滴大，速度快、角度大 -血膜厚,染料(天然染料和人工染料）发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。,五、血细胞常用的染色方法,碱性染料：阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料（如亚甲蓝、天青） 酸性染料：阴离子染料，能释放质子。能结合细胞的
12、碱性成分并染色，如血红蛋白，嗜酸性颗粒成分等。 复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料,染料的分类,物理作用：渗透、吸收、吸附作用等化学作用：a、染料的化学成分：助色基团的存在。碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。,细胞着色原理,b. 蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其他活性基团。在游离状态时， -NH2获得一个H+变成带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。,化学作用,C.周围环境的酸碱度
13、：如环境pHpI（ pI 为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之， pHpI，则结合碱性染料。,化学作用,染色原理分两相进行，第一相是酸性伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒结合；碱性染料天青B与细胞中的酸性物质如核染色质、特异中性颗粒、血小板结合。第二相是天青B和伊红结合在适宜条件下形成紫色的天青B-伊红复合物，结果使白细胞核染色质成紫色（疟原虫的染色质成红色），中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区成紫色。,瑞氏染色法,试剂1. Wright染液 瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表
14、面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。,瑞氏染色法,试剂2.磷酸盐缓冲液（PBS）磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。,瑞氏染色法,a. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上 b. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min c. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色10-15分钟 d. 用清水冲洗，待干后油镜镜检,瑞氏染色方法,染 色,待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wrights染液盖满血膜为止，染色1 min。然后滴加等量或稍多缓冲液，使其与染液均匀混合，静置1015 min。用流水缓缓冲去染液，待干镜检。
15、,染色原理 基本成分仍然是伊红和亚甲蓝，改进了染料的质量，使细胞核着色好，结构显示更清晰，而胞浆和中性颗粒染色较差。试剂 Giemsa染液 甲醇 纯甘油,姬姆萨染色法,1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检,姬姆萨染色方法,瑞氏和姬氏染粉按一定比例混合，用甲醇溶解配制成瑞-姬染液。染色过程和染色原理与瑞氏染色类似。,瑞-姬染色,新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，应贮存一段时间后再用。 不能使用肝素抗凝标本 玻片必须清洁、干燥、无尘。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面,染色注意事项,制作涂片时根据血细胞比容、血粘度的高
16、低决定应采用血滴的大小及推片的角度和速度。 血涂片干透后方可固定染色。 根据染液浓度、室温及细胞多少决定染色时间 低倍镜下观察血涂片染色质量。,染色注意事项,瑞氏染色对胞浆着色好，胞浆中的嗜天青、嗜酸性、嗜碱性等颗粒染色清晰、 色泽纯正，细胞核着色不理想 姬氏染色对细胞核着色程度适中，染色后细胞核结构清晰，胞质染色较差 瑞-姬染色使瑞氏及姬氏染色取长补短，优势互补,方法学评价,染色效果观察,染色效果观察,原理 待测标本经过适当稀释（或浓缩）后，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的细胞，再换算成每升标本内的细胞数。方法评价 常用于各种细胞成份的计数，亦可用于其他体液的细胞计数。计数误差大，不适
17、用于大批量标本检测。,六、血细胞显微镜计数法,普通光学显微镜 一次性微量吸管 改良年鲍氏计数板（Neubauer） 盖玻片（24*20*0.6）,使用器材,改良年鲍计数板（Neubauer）,每块计数板分为上下两个计数池，计数池两侧各有一条支柱，用支撑盖玻片，立柱高度与计数池相差0.1mm,计数板构造,计数室边长为3.0mm,划分为9个大方格,每一大方格边长为1.0mm,面积为1.0mm2,和盖玻片之间形成的体积为0.1mm3,四角四个大方格单线划为16个中方格;中央大方格双线划为25个中方格。,Neubauer计数室构造,1.检查、清洗计数板 计数板上有污物或水分会影响计数结果的 准确性 2.加盖片 将合适大小的盖玻片搭放在两侧 的平台上 3.充池 充池之前先将标本充分混合均匀,操作方法,4.静置 静置5分钟左右，使细胞沉降到计数板上 5.计数 显微镜下选择相应的计数的方格进行计数 6.换算 根据计算公式，将结果换算成标准数据,操作方法,计上不计下，计左不计右,压线细胞计数原则,技术误差（technical erros）由操作不规范，试剂变质或仪器状态改变等原因造成的误差，可避免或减小。 固有误差（inherent errors）由使用器材本身携带的误差，和计数池内血细胞自然分布不均等造成的原因，无法避免。,计数误差,谢 谢,
