1、本课题学习目标本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：、主要概念： 凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2. 主要原理：主要原理： 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理本课题学习重点和难点本课题学习重点和难点体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。3、课题重点：、课题重点： 凝胶色谱法的原理和方法 4、 课题难点：课题难点： 样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2003年年
2、4月月 14日宣布人类基因组序列图完成，这日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：人类基因组： 指指 DNA分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息蛋白质组：蛋白质组： 生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。是对蛋白质功能的研究。血血液液血浆血浆 水水 分分固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、 无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（ 90）两个两个 肽链肽链两个两个 一肽
3、链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.提问：提问： 血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.提问：提问： 用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取 DNA，用猪、牛、羊的，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有 DNA，便于进行，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血血 红红 蛋白蛋白（一）（一） 凝胶色谱法（凝胶色谱法（ 分配色谱法分配色谱法 ）2.凝胶：凝胶： 大多数凝胶是由 多糖
4、类化合物 （如 葡聚糖或琼脂糖 ）构成的 多孔 小球体， 内部有许多贯穿的 通道。根据被分离物质的蛋白质 相对分子质量 的大 小，利用具有 网状结构 的凝胶，来进行分离。1.概念：概念：3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢 ; 而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 依据的特性是：依据的特性是： 蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法凝胶色谱法 分离蛋白质 的原理和的原理和 具
5、体过程具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液1.概念概念 : 在一定的范围内，凡是能够抵制 外加少量强酸或强碱 的影响使原来溶液 PH值基本保持 不变的混合溶液。能够抵制 外界的酸和碱 对溶液 PH值 的影响，维持 PH基本不变。2.作用作用 :3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制 : 通常由 1 2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 使用比例 就可以制得在 不同 PH范围内 使用的缓冲液。4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是 :_ ,其目的是其目的是 : 利用缓冲液模拟细胞内的 PH环境，保证
6、血红蛋白的正常结构和功能，便于观察 (红色红色 )和科学研究 (活性活性 )磷酸缓冲液缓冲溶液的组成及分类缓冲溶液的组成及分类 弱酸及其对应的盐： 弱碱及其对应的盐： 多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐 :H2CO3NaHCO 3 ； CH3COOHCH 3COONaNH3H2ONH 4CL ; NH4OHNH 4CLNaHCO3Na 2CO3 ； NaH2PO4Na 2HPO4缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为 共轭酸 ；能对抗外来强酸的称为 共轭碱 。这一共轭酸碱通常称为 缓冲对、缓冲剂或缓冲系 。常见的缓冲对主要有如下三种类型：常见的缓冲对主要有如下三种类型：（
7、三）（三） 电泳：电泳：1.概念：概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的 PH下，这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 。3.类型类型 :琼脂糖 凝胶电泳、 聚丙稀酰胺 凝胶电泳。在在 电场电场 的作用下，的作用下， 这这 些些 带电带电 分子分子 会会 向着向着与与 其所其所 带电带电 荷相反的荷相反的 电电 极极 移
8、移 动动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用 十二烷基硫酸钠（ SDS） 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺在 引发剂 和 催化剂 的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的 迁移率 取决于它所带 净电荷 的多少以及 分子的大小 等因素。（ SDS的作用）的作用） 为了消除 净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入 SDS。2.原理：原理：SDS能使蛋白质发生完
9、全变性能使蛋白质发生完全变性 。由几条肽链组成的 蛋白质复合体 在 SDS的作用下会 解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量单条肽链的分子量 。 SDS能与各种蛋白质形成 蛋白质蛋白质 SDS 复合物复合物 ， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子 原有的电荷量原有的电荷量 。因而掩盖了 不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别 ，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS作用机理作用机理 :用 SDS测定蛋白质分子量的方法使用使用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组 已知分
10、子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白 同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的量的标准蛋白的 电泳区带位置电泳区带位置 ，用，用 电泳迁电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线移率和分子量的对数作标准曲线 ，可以测，可以测定定 未知蛋白质未知蛋白质 的分子量。的分子量。 市场上有高分子市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。剂出售。二、实验操作二、实验操作样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定1.样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的
11、洗涤红细胞的洗涤 : 洗涤目的洗涤目的 : 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。 洗涤操作：洗涤操作： 1、采集血样。 2、低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为 0.9的氯化钠溶液洗涤。 5、低速离心 （低速短时间） 6、重复 4、 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。采集得到血液柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放： 加蒸馏水到 原血液体积 ，再加 40体积的 甲苯 ，置于 磁力搅拌器 上
12、充分搅拌 10分钟（ 加速细胞破裂 ） ,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液： 过程：过程： 将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心 10 min。 试管中溶液层次：试管中溶液层次： 第 1层（最上层）：甲苯层（ 无色透明 ）；第 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（ 白色薄层固体 ）；第 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（ 红色透明液体 ）；第 4层（最下层）：杂质沉淀层（ 暗红色 ）。 分离：分离： 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 红色透明液体 。二、实验操作二、实验操作磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作甲苯层甲苯层 （ 无色透明无色透明 ）白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层 （ 暗红色暗红色 ）试管中溶液层次试管中溶液层次(4)透透 析：析： 过程：过程： 取 1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的物质的量浓度为 20mmol/l的 磷酸缓冲液 中（ pH为 7.0），透析 12小时。 透析目的：透析目的： 除去样品中分子量较小的杂质。二、实验操作二、实验操作透析过程动画演示透析过程动画演示利用透析袋透析
