1、2018/10/18,1,主讲教师：姚彤炜,吴永江浙 江 大 学 药 学 院2007.911,高等药物分析 Advanced Pharmaceutical Analysis,2018/10/18,2,教学进度与课程安排,2018/10/18,3,注：第10章内容课外抽时间查文献 ，分组会上发言。,2018/10/18,4,第一章 色谱基础理论,概 述,色谱法是利用物质在不同的两相中分配、吸附或其他亲和作用的差异，通过多次重复使微小的差别积累起来变成大的差异，从而使混合物中各组分达到分离。 色谱技术在近三十多年中的飞速发展已形成一门专门的科学，称为色谱学。广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最
2、重要的分离分析方法。,2018/10/18,5,色谱法的分类,按流动相与固定相的分子聚集状态分类 气相色谱法（气-固，气-液） 液相色谱法（液-固，液-液） 超临界流体色谱（SFC）按操作形式分类 柱色谱，平面色谱，逆流分配,2018/10/18,6,按色谱过程的分离机制分类,吸附色谱（adsorption ） 利用吸附能力的差别； 分配色谱（partition ） 利用分配系数的差别； 空间（分子）排阻色谱（steric exclusion ）或称凝胶色谱法（gel ）利用被测物分子大小不同而导致的渗透系数差异。,2018/10/18,7,离子交换色谱（ion exchange ）利用在离子
3、交换树脂上的交换能力差别。又可分为: 氨基酸分析（aminoacid analysis） 离子色谱法（ion chromatography） 亲合色谱（affinity ）将生物活性配位基（酶、辅酶，抗体等）键合到载体表面形成固定相，利用亲合力大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品）。,2018/10/18,8,毛细管电色谱（capillary electro- ）依靠色谱与电场两种作用力，利用分配系数和电泳速度差别而分离。 毛细管电泳 （capillary electrophoresis）以高压电场为驱动力，根据样品组分的淌度和分配系数而分离。 手性色谱（chiral chromatograp
4、hy）利用手性识别原理，用于手性药物的分离分析。,2018/10/18,9,2018/10/18,10,色谱法特点具有分离、分析功能，可排除组分间的相互干扰，将组分逐个进行定性、定量。发展快，应用广。 色谱法在药物分析中应用主要用于成分复杂的样品，如：制剂分析、 中成药、天然药物提取分离、合成化合物纯度、有关杂质分析、残留有机溶剂分析、残留农药分析、药代动力学、生物利用度，治疗药浓监测、生物制品药物分析、临床诊断、法医鉴定等。,2018/10/18,11,色谱法发展 向自动化、联用型、人工智能化方向发展： 色谱-光谱联用 气相色谱-付里叶变换红外光谱 高效液相-紫外吸收光谱 气相色谱-质谱（G
5、C-MS） 高效液相-质谱（ HPLC- MS） 高效液相-付里叶变换红外光谱 超临界流体色谱-质谱 薄层色谱-紫外吸收光谱 毛细管电泳-质谱,2018/10/18,12,色谱-色谱联用 指二种色谱方法的联用，也称二维色谱法。目的是用一种色谱法补充另一种色谱法分离效果上的不足。常见的有： 气相色谱-气相色谱 高效液相-气相色谱 高效液相-高效液相 高效液相-薄层色谱 二维薄层色谱 色谱-色谱联用法可提高分离效果，获取更多的定性分析信息。,2018/10/18,13,血浆中卡维地洛尔非手性/手性色谱分离实验装置,第1阀（04.2min,实线位置；4.218min,虚线位置）；第2阀（03.7mi
6、n,实线位置；3.718min,虚线位置）。,废液,例,2018/10/18,14,2018/10/18,15,热力学理论塔片理论是由平衡的观点来研究分离过程，是一种半经验理论，以塔片理论为代表。 动力学理论速率理论是从动力学观点，即速度来研究各种动力学因素对柱效的影响，以Van Deemeter方程式为代表。,色谱理论,2018/10/18,16,基本概念 色谱峰（peak）样品产生的电信号强度对洗脱时间作图。称为流出曲线，浓度 -时间曲线，也称色谱带（band）。 色谱峰有三种形式： 对称峰 拖尾峰（tailing peak） 前延峰（leading peak）,t(min),C,2018
7、/10/18,17,峰形参数： 对称因子（symmetry factor，fs）fs =(A+B)/2A； 或用： 拖尾因子（tailing factor，T）来衡量T=W0.05h/2d1T=0.951.05(正常峰) T0.95(前延峰) T1.05(拖尾峰),2018/10/18,18,T=W0.05h/2d1， 或fs=(A+B)/2A,W0.05h = x =h/20,峰的对称性,2018/10/18,19,例1 测得某一物质的色谱峰高为2.55cm,则其0.05h=0.6275cm, 量取：W0.05h= 0.575cm， 量取：A= 0.285cm 计算T或fs，根据 T=W0.
8、05h/2d1 fs=(A+B)/2A,T = 0.575 cm /（2 0.285）cm=1. 009,x = 0.05h,2018/10/18,20,一个色谱峰，可用三项参数来描述： 峰高或峰面积定量 峰位（保留值）定性 峰宽 衡量柱效,2018/10/18,21,基线（base line ）在操作条件下，检测器中只有流动相通过时的流出曲线称为基线。它反映了仪器的噪音随时间的变化。 噪音（noise ，N）各种未知的偶然因素引起的基线起伏的现象称为噪音。噪音的大小用噪音带的宽度来描述。,基线漂移,2018/10/18,22,定性参数 保留值 保留时间，保留体积 相对保留值 保留指数,201
9、8/10/18,23,保留值 保留时间（retention time ，tR）进样开始到组分色谱峰顶点时间间隔。 死时间（dead time ，t0或tM）流动相通过色谱系统的时间。 t0或tM的测定： GC用空气峰（热导检测）或甲烷峰（FID）测定 HPLC溶剂峰前沿出现的时间，或用不被固定相吸附或溶解的组分，如NaNO3（210nm测定）的保留时间。,2018/10/18,24,调整保留时间（adjusted retention time， tR ）也称为校正保留时间某组分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留的时间，即： tR= tR t0，在实验条件一定（温度、
10、固定相）， tR决定组分的性质，故tR是定性的基本参数。,2018/10/18,25,2018/10/18,26,保留体积（retention volume，VR），又称洗脱体积流动相携带样品进入色谱柱，由进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时，通过色谱柱的流动相体积。对于对称峰，VR为样品组分被流动相带出色谱柱1/2量时所需流动相体积：VR = tR FcFc为流速（ml/min），Fc一定时，VR 与 tR 成正比。 Fc大时tR就短，VR与流速无关。,2018/10/18,27,相对保留值（1,2)指组分（1）与参照物（2）两者调整保留值的比值。1,2= tR（1）/ tR（2） = K
11、1/K2 (K为分配系数）,保留指数（I，Kovats指数）是把组分的保留行为换算成相当于含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述。,2018/10/18,28,以正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值的标准物。方法如下： 用两个保留时间紧邻待测组分的标准物质来标定待测物的保留指数（Ix）Ix =100Zn z与 z+n代表含有z与z+n个碳原子的正构烷烃，n 可为1、2，通常n=1。,lg tR(x) lg tR(z),lg tR(z+n) lg tR(z),2018/10/18,29,例：乙酸正丁酯I值的测定，在一定色谱条件下（固定相，柱温），用正庚烷及正辛烷标定。,2018/10/18,30,
12、n-C7：tR=174 n-C8：tR=373.4 乙酸正丁酯： tR=310 z=7，z+n=8，n=1Ix =10071 =775.6说明乙酸正丁酯在该色谱条件下的保留行为相当于含有7.756个碳的正构烷烃的保留行为。,lg 373.4 lg 174,lg 310 lg 174,2018/10/18,31,在HPLC中应用的参照标准为系列烷酮： 脂肪族甲基酮系列 烷芳基酮系列 1硝基烷烃系列,例：应用脂肪族甲基酮系列（丙、丁、戊、己、庚酮）对含黄酮类中药的指纹图谱进行定性，考察了柱温、流动相、色谱柱、HPLC仪等条件的微小变化对指纹图谱的影响，比较共有峰的保留时间、相对保留值和保留指数的R
13、SD，结果保留指数的RSD是最小的。,2018/10/18,32,样品,样品+37个碳烷酮,2018/10/18,33,三种定性参数比较 保留值受色谱条件的影响大，通用性较差。 相对保留值减少了色谱条件的影响，但对多组分的复杂样品，保留值差别较大，只选一种参照物误差较大。 保留指数是国际公认的色谱定性指标。有很好的重现性和准确性 。可利用文献的保留指数进行定性，而不需纯品对照。,2018/10/18,34,此外保留指数还与温度、分子结构有密切关系： 与温度有线性关系由此可求出不同柱温下 的保留指数（GC法）。 例：某物的保留指数在100是654，150 是688 ，则可求出125 时的保留指数
14、应为671。 与分子结构有密切关系可通过分子结构来预测保留指数或反之。,2018/10/18,35,柱效率的参数（色谱峰的区域宽度） 标准差（，standard deviation) 半峰宽（peak width at half-height，W1/2或Y1/2） 基线宽度（peak width，W或Y）,2018/10/18,36,标准差在正态分布曲线中，将x=1处（拐点）的峰宽之半称为标准偏差。在实际工作中,标准差为峰高0.607h 处的峰宽之半。 峰形窄， 小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。,2018/10/18,37,半峰宽也称半腰宽，为色谱峰高之半处的峰宽。W1/2=2.355 ，
15、 W1/2易确定，且比值大，故测量误差较小。,2018/10/18,38,峰宽也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐点作切线,在极限上所截的距离,称为峰宽。 对色谱峰两侧作切线后为等腰三角形，底边为峰宽，而为等腰三角形高度之半处的宽度之半，所以 ：W=4,2018/10/18,39, ,W,h,0.5h,0.607h,W1/2,W1/2=2.355 ，W=4=1.699W1/2,2018/10/18,40,差速迁移（differential migration）色谱过程是物质在相对运动着的两相间，分布平衡的过程。若混合物中二个组分的分配系数或吸附平衡常数不等，则被流动相携带移动的速度不等。因差速迁移而
16、被分离。,2018/10/18,41,分配系数（partition coefficient，K ）在一定条件下，达到分配平衡后：样品组分在固定相中的浓度（Cs） 样品组分在流动相中的浓度（Cm）K = Cs / Cm,2018/10/18,42,K与保留时间（ tR ）的关系： tR = t0 （1+KVs/Vm） tR= t0 KVs/Vm Vs为色谱柱中固定相体积， Vm为色谱柱中流动相体积，即固定相间隙体积。 分配系数大柱上停留时间长 物质的性质及色谱条件 K tR,2018/10/18,43,容量因子（capacity factor，k）（保留因子retention factor， 分
17、配比partition ratio） k表示平衡后组分在两相中的质量比。 k= K（Vs/Vm），（K = Cs / Cm ） k =（Cs Vs）/（Cm Vm）=Ws/Wm 又根据tR= t0 KVs/Vm，则有： k= tR/t0= tR/t0 -1 tR = t0（k+1）,2018/10/18,44,色谱法中 最佳分离 条件与可 用范围的 k值如表 所示：,根据tR = t0（k+1）， 有： k=0， tR = t0k=1， tR = 2t0,无保留,2018/10/18,45,分离参数 分离参数用于衡量分离条件的优劣，常用分离度，表示。 分离度（resolution，R）R=即相
18、邻两峰分开的距离是平均峰宽 (W1+W2)/2的几倍。 R大, 分离效果好。,2018/10/18,46,2018/10/18,47,例： 混合物中两组分A和B在25cm长的色谱柱上的tR分别为16.40min和17.63min，而两个峰宽分别为0.555cm和0.605cm ，纸速0.5cm/min, 求分离度。,首先换算峰宽单位：0.555cm / 0.5cm =1.11min0.605cm/ 0.5cm = 1.21min,2018/10/18,48,影响分离度的因素 分配系数比（） 容量因子（k） 柱效（n）,从三者对分离度R关系的公式看，1是分离的前提。要将各组分分离， 必须选择适宜
19、的固定相、流动相流速、柱温等。,2018/10/18,49,a为柱效项，b为柱选择性项，c为容量因子项。 =K2/K1= tR2/ tR1= k2/ k1, 在K1 K2 的前提下，柱效项与容量因子项越大，分离度越大。,a b c,2018/10/18,50, 1.01 1.1 （9%），R （ 9倍） 1.5 2.0 （33%），R (1.5倍) 上表说明在1附近变化，对分离度R改善非常有效。,2018/10/18,51,在1的前提下，柱容量k值越大，R也越大。但当k超过20时， k再增加， k/（1+k）增加不明显。一般k不超过20。,2018/10/18,52,假定n=5000,2018
20、/10/18,53,假定k=3,2018/10/18,54,假定a=1.1,2018/10/18,55,塔板理论 把色谱柱看作一个分馏塔，在每个塔板的间隔内，样品混合物在气液两相中达到分配平衡，经多次分配平衡后，分配系数小的组分（挥发性大的组分）先到达塔顶（先流出色谱柱）。由于色谱柱的塔板相当多，因此分配系数的微小差别就可获得很好的分离效果。 在柱内一小段长度H内（相当于一个分馏塔），组分可以很快在两相间达到平衡，H称为理论塔板高度。,2018/10/18,56,理论板数（n）与理论板高度（H）n=（tR/）2n=5.54 （tR/w 1/2）2n= 16 (tR/w)2n 越大 ，柱效越高。
21、 如果用tR计算理论板数，所得值为有效理论板数 n有效,2018/10/18,57,理论板数取决于： 固定相种类、性质、填充状况、柱长； 流动相及其流速； 被测物性质等。 理论板高 (H) H=L / n L为色谱柱长度，当L一定时，H与n呈反比，即H越小，柱效越高。,2018/10/18,58,例： 测得某一物质的保留时间为1.5min，半峰宽为0.2cm，柱长2m，记录纸速为2.0cm/min，求n和H？n=5.54（ ）2=1246H=2000/1246=1.6mm,1.5min,0.2cm,2.0cm/min,2018/10/18,59,塔板理论在解释流出曲线的形状、浓度极大点的位置及
22、评价色谱柱柱效等方面是成功的。 但塔板理论不能解释柱效随流动相流速的改变而不同的原因。不能说明影响塔板高度有哪些主要因素？即影响峰扩张的原因。,2018/10/18,60,速率理论 速率理论是把色谱过程看作一个动态过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽的影响。 气相色谱 Van Deemeter方程式 HPLC速率方程式Giddings 方程式,2018/10/18,61,气相色谱速率理论方程式H=A+B/u+Cu u为载气的线速度 A、B、C是影响峰扩张的三项因素：,2018/10/18,62,样品组分在气、液两相中分配，经溶解、扩散、平衡及转移的整个过程称传质过程。 常数C称为传质阻抗系数，
23、为固定相和流动相的传质阻抗系数之和：C= Cs+ Cm，因Cm很小， C Cs，其与固定相厚度有关。,2018/10/18,63,液相色谱速率理论方程式 H=A+B/u+Cmu+Csmu+Csu 组分在流动相中的扩散系数与流动相的分子量平方根成反比。由于流动相为液体，分子量较气体大得多，因此纵向扩散项 B/u可忽略。 Csmu为静态流动相传质阻抗。将三个传质阻抗系数（ Cmu、Csmu、Csu ）合并，得：H=A +C u 可以近似地认为流动相的流速与板高成直线关系，流速增加，柱效降低。一般采用1ml/min。,2018/10/18,64,2018/10/18,65,此外 应注意 影响色谱峰 展宽的柱外效应,
