1、第三章 细胞生物学研究方法,Chapter 3 Methods and Techniques in Cell Biology,生物学研究一般规律,Outline,第三节 细胞培养及细胞工程一、动物细胞的分离及培养二、植物细胞的培养三、细胞工程（一）细胞融合与细胞杂交技术（二）单克隆抗体技术（三）细胞显微技术 第四节 模式生物,第一节 形态学研究方法一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、扫描隧道显微镜技术 第二节 细胞组分的分析方法一、细胞组分的分离二、细胞组分的化学染色三、放射自显影技术四、显微分光光度技术五、分子杂交技术六、流式细胞技术七、免疫学方法对细胞组分的分析,第一节 形态学研究方法
2、,一、光学显微镜技术 （一）普通光学显微镜及其标本的制备 （二）荧光显微镜及其应用 （三）扫描激光共聚焦显微镜及其应用 （四）相差显微镜 （五）暗视场显微镜 （六）微分干涉显微镜 （七）荧光能量共振转移技术 （八）荧光漂白恢复技术,1、构成 照明系统：光源 光学放大系统：物镜、目镜、聚光器和光阑 机械装置：镜筒、物镜转换器、镜臂镜座、 载物台、调焦螺旋,Olympus显微镜的结构图,（一）普通光学显微镜,2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,光学显微镜的放大原理和光路图,普通光学显微镜光路图,3、主要的性能参数,（2）孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心
3、光线OA之间的夹角/2称为孔径角。 （3）数值孔径：令NA = nsin (/2), 叫物镜的数值孔径。数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率越高。,（1）分辨率：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。D=0.61/ nsin (/2)D：分辨率 :光波的波长n:介质折射率 :物镜镜口角(标本在光轴的一点对于物镜镜口的张角),sin/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400 700nm，分辨力数值不会小于0.2m，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设
4、计倍数为1000X。,制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65 1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。,几种介质的折射率,4、显微镜的几个光学特点,5、观察标本的制备：,复水 染色 脱水 透明 封片 观察,取材 固定 脱水 包埋 切片 脱蜡,第一步. 固定(fixation)目的：使大分子交联而保持固定，不至在后面过程中移位或丢失。试剂：甲醛、戊二醛机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键，将邻近蛋白分子交联。 第二步. 脱水,第三步. 包埋（embed）目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。试剂：蜡、树脂机理：可进入细胞内，起支持作用。 第四步. 切片（section）目的：切成薄片，便于切片
5、黏附在载玻片上进行染色。仪器：切片机切片厚度：110 m,第五步.染色（staining）目的：使细胞成为可见.方法：A.选择性染色苏木精细胞内核酸的分布伊 红细胞质染色B.特异性染色酶 + 底物 抗原 + 抗体,（二）荧光显微镜 (Fluorescence microscope),1. 原理:荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光。,2.基本构造：A 光源B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光,荧光显微镜光路图,3. 荧光的观察: 1. 自发荧光某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿素。 2.二次荧光非荧光性物质用
6、荧光色素染色后，可产生荧光（二次荧光），以便于进行观察 。,3.抗体荧光技术带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合，这样就能通过抗体结合的荧光观察到抗原。 4.绿色荧光蛋白,图示： 鼠主动脉平滑肌的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red,200ng/ml ADM 处理BNL-CL2后细胞微丝骨架的荧光观察,对照组,原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的抗原进行反应，在荧光显微镜下观察到明亮的特异荧光。 荧光素标记抗体的方法直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。,4. 免疫荧光显微镜技术 （Immunoflu
7、orescence microscopy）,发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 应用: a.特异蛋白质等大分子的定位b.观察过氧化物酶体,5. 绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP,载体(GFP基因待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察待定蛋白质在细胞内的位置分布,特异蛋白质生物大分子定位,观察过氧化物酶体,GFP 过氧化物体内的酶（有定位信号）导入不同细胞荧光显微镜下观察各种细胞的过氧化物酶体,（三）激光共聚焦扫描显微镜 （Laser confocal scann
8、ing microscope, LCSM）,“显微CT“,激光作扫描光源扫描焦平面上样品，得样品切面像载物台上微量步进马达使载物台上下移动,改变焦平面得不同层次的切面图像计算机图像三维重组获样品立体图像,分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通光镜的3倍。 应用： 观察细胞形态统计光密度来定量细胞内成分三维重建,（四）相差显微镜,1. 1953年诺贝尔物理奖 2. 特点: 可用以观察活细胞。 3. 原理: 波长 颜色振幅 亮度速度 相位,普通显微镜: 光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。但光通过活细胞时，波长和振幅几乎无改变，这就无法
9、用人眼观察。 相差显微镜细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成“振幅差”，即图像的明暗差。,通过致密部分(如细胞核),速度慢 通过疏松部位(如细胞质),速度快,倒置相差显微镜,载物台的上方：光源长焦距聚光器载物台的下方：物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察,培养中的上皮细胞,活细胞的有丝分裂,在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。 制造暗视野显微镜的灵感,（五）暗视野显微镜,原理: 利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照
10、射光无法进入物镜，故呈暗视野。只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。,分辨率：典型的动物细胞 1020 m一般的细菌和线粒体 0.5m (500nm) 普通显微镜 0.2m(200nm)暗视野显微镜 0.004-0.2m(4-200nm) 应用：能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。用以观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以及液体介质中的细菌等微粒的运动 。,显微电影摄影 记录细胞或细胞器运动过程和速度,用显微电影摄影术或电视录像以一定间隔拍摄一次细胞状态，当影片或电视录像以正常速度反映时，所拍摄的情节就被大大加快了，用这种方法可以准确地记录细胞或细胞其的运动过程和速
11、度。,（六）微分干涉显微镜,A普通明视场显微镜；B相差显微镜； C微分干涉显微镜,微分干涉显微镜以平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束光会合，从而样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品反差并且极有很强立体感，适于研究细胞中较大的细胞器。,荧光共振能量转移原理图,（七）荧光能量共振转移技术（FRET）,（八）荧光漂白恢复技术(FRAP),荧光漂白恢复技术原理图,二、电子显微镜,（一）透射电子显微镜 （ transmission electron microscope, TEM）,1. 原理 以电子束作光源，电磁场作透镜
12、。电子束波长短，且波长与加速电压(通常为50120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结构（submicroscopic structures）。,电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧屏上。由于散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而形成明区。
13、,2. 透射电镜生物标本制作：,取材 固定：防止产生结构改变。戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。四氧化锇：除与蛋白共价结合外，还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本不能含水。梯度乙醇。,(4)包埋：为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片：电子穿透力很弱,需将样品制成50100nm厚薄片。约为细胞的1/200厚度。 (6)染色：生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差，进行染色。重金属浸染。
14、,3、透射电镜提高样品反差的方法,原理：用只沉积于样品周围的、比样品密度高的物质(如磷钨酸)对样品进行染色，使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。应用：适用于颗粒或纤维等游离的样品。特别是在病毒性致病因子的超微病理诊断中广泛应用。,（1）负染技术,冰冻蚀刻freeze-etching,标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。,随样品表面结构的高低起伏，重金属形成不同厚度的薄膜，显示了投影效果，给出了一个样品表面结构的三维图像。,4、电镜三维
15、重建技术,（二）扫描电子显微镜（ Scanning electron microscope，SEM）,1、扫描电镜的成像原理阴极钨丝加热后产生的电子束经过栅极和阳极加速和会聚，再经二级聚光镜及物镜会聚形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束；,电子束在扫描线圈驱动下，在试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射。二次电子发射量随试样表面形貌而变化；二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。,Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the s
16、tereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).,蛙的内耳毛细胞,（三）扫描隧道显微镜 （scanning tunneling microscope，STM）,1、原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针
17、尖在一定高度（100nm以内）上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 2、分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。 3、用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,第二节 细胞组分的分离及分析技术,一、细胞组分的分离离心技术,是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达1000
18、00r/min。,（一）差速离心 Differential centrifugation,1、特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。 2、用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,（二）密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）pH中性或易调为中性； 3
19、）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。,1、速度沉降velocity sedimentation,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离的目的。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,2.等密度沉降 isopycnic sedimentation,用途：分离密度不等的颗粒。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 特点：1）介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。2）所需
20、的力场通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。,Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation,组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 1. 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）显示方法,二、细胞组分的化学染色,1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成Co
21、S或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 3. 联苯胺反应：过氧化物酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质。,三、放射自显影术,用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C
22、和3H标记。常用3H-TdR来显示DNA，用3H-UdR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。,四、显微光谱分析技术,细胞中一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收谱线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。,五、分子杂交技术,具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（in situ hybri
23、dization）用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了荧光探针法。,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,（二）Southern杂交,是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上， 用探针杂交， 则称为Northern杂交。,1、PCR：polymerase chain reaction 2、反应体系：样品DNA；引物（primer），约15-20个核苷酸；4种dNTP；Tag
24、 DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度7580，短时间在95下不失活。缓冲体系和Mg2+。 3、反应过程：变性：约90-95；复性：约60左右；延伸：70-75；重复“变性-复性-延伸” 过程20-30次循环。,（三）PCR技术,PCR原理,六、流式细胞技术,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称
25、为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。,细胞电泳原理：在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。,单细胞凝胶电泳单细胞水平的DNA损伤检测原理：真核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，该方法用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的
26、环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液(pH=8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。用途：检测单细胞水平的DNA损伤。,小鼠胚胎肝细胞经不同浓度阿霉素处理后DNA损伤情况,对照组 100ng/ml阿霉素 200ng/ml阿霉素,（一）免疫细胞化学 immunocytochemistry,根据免疫学原理
27、，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（immunofluorescent technique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。,七、免疫学方法对细胞组分的分析,（二）免疫电镜技术,Gold particles coated with protein A are used to detect an antibody-bound protein by transmiss
28、ion electron microscopy.,（三）免疫印迹Western blotting 技术,八、其它生化分析方法,1.三维结构的分析X射线晶体衍射 2.蛋白质的分离纯化电泳、层析、色谱等,第三节 细胞培养及细胞工程 一、细胞培养,（一）动物细胞培养,群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。,Population cell culture,Cloning cell c
29、ulture,原代培养（primary culture）：即培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）。细胞系（cell line）：具有特定生物学与遗传学特征，且能在体外稳定永久生生长的细胞群体。通常可来自肿瘤组织的细胞群或培养中发生突变或转化的细胞。有限细胞系永生化细胞系细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。,常用的几种细胞系,（二）植物细胞培养,1. 外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。2. 悬浮细胞培养：适合于进行产业
30、化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。3. 原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点： 比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； 便于进行细胞融合，形成杂交细胞； 适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。4. 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。,二、细胞工程 （一）细胞融合,通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。,自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒
31、、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。,（二）单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而发明了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,（三）显微注射技术,尼康NT-88NE显微操作/注射仪,显微操作技术（micromanipulation technique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micromanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显
32、微镜视野内移动的机械装置。,显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。,第四节 模式生物,由于基因在进化上的保守性和遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息通常也适用于其他生物。模式生物通常具有个体小、容易培养、操作简单、生长繁殖快等特点。,思考题,名词解释：激光共聚焦显微镜 荧光漂白恢复技术 荧光能量共振转移技术 冷冻蚀刻技术 电镜负染技术 透射电子显微镜 显微分光光度术 原代培养 克隆培养 细胞系 细胞株 原生质体 模式生物 简述生物学研究的一般策略路线。 决定显微镜分辨率的参数有哪些？提高显微镜分辨率的途径有哪些？ 免疫荧光显微术的原理与应用。 流式细胞技术的原理及应用。 透射电镜及扫描电镜技术的原理及成像特点。,
