1、8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,教学目的与要求了解植物遗传转化的受体，以及植物遗传转化的方法与原理。,自1983年第一个转基因植物问世以来只有20多年的时间，但植物基因工程的发展日新月异，硕果累累。将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。植物基因工程具有得天独厚的优势是植物细胞的“全能性”理论。这是动物细胞所不能比拟的，其次是植物基因工程不会像动物或人类基因工程那样遇到较多的社会、伦理、道德等问题。植物基因工程为育种开辟了一条崭新的途径。经过十多年来得探索，基因转化的技术日臻
2、成熟，已经形成了以农杆菌载体转化和基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。这两种转化系统机理清楚、证据确凿，成功的例子最多，约占已获转基因植物的90%以上 。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,学习后的感受：1.植物遗传转化受体？2.植物遗传转化方法？3.转基因植株的再生？4.转基因植株的检测？,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体,所谓基因转化受体是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，转化选择抗生素敏感的再生系统。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATIO
3、N,创伤植株,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体,尽管接受外源基因的受体包括叶圆片(盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态，但其基本形态还是细胞。其中，叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.1 原生质体,原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。水稻
4、广亲和品种02428的原生质体用聚乙二醇(PEG)法导入具有潮霉素B(HPT)抗性基因、卡那霉素抗性基因(KanR)和昆虫荧光素酶基因(Luc)的质粒 pTHL27DNA，在含有25g/ml潮霉素B和100g/ml卡那霉素的培养基KPR和N6上连续培养处理4周，可以很好地除去非转化的敏感的原生细胞；然后在无抗菌素选择压力的培养基中，转化细胞可再生植株(杨歧生等， 1996)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞,以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电激法和显微
5、注射法等。小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表达的各项最适参数。他们还建立了冀谷11号谷子幼穗的悬浮培养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基，20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测GUS短暂表达频率TTF为20-40%；在添加200mg/L卡那霉素的MS培养基上，有5-10的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代(董云洲等，1998)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.3
6、 胚性愈伤组织,愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。 芹菜胚性愈伤组织用根癌农杆菌C58C1 (pBZ6111)感染后，在MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.4 胚状体,胚状体是由愈伤组织经过
7、改造后分化而来的，其转化方法也同愈伤组织。 用根癌农杆菌LBA4404介导番木瓜环斑病毒外壳蛋白（PRSV-CP）与核酸酶（Nuclease）嵌合基因，通过振动共培养法转化番木瓜子叶型胚状体，在选择培养基上筛选诱导再生转基因植株。NPT II分析和Southern blot分子杂交结果表明，PRSV- CP- Nuclease嵌合基因已经整合到番木瓜核基因组中（周鹏等，1995）。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.5 叶圆片,叶圆片(叶盘)是农杆菌转化的主要受体。采取新鲜植株上无菌的幼嫩叶片，用打孔器
8、或解剖刀切取直径3-5mm的叶圆片，在液体培养瓶中与农杆菌共培养20-30min，其间轻轻摇动使农杆菌从切口侵入叶片。然后将共培养后的叶圆片在滤纸上吸干，转移到非选择性培养基上培养3d，再转入含卡那霉素或羧苄青霉素等抗生素的选择培养基上培养，诱导植株再生，这样可获得遗传均一性较高的转基因植株。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.5 叶圆片,叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化，马铃薯“东农303的叶盘用含有质粒pPZH1和辅助质粒pGV2260双元载体的根癌农杆菌菌株C58C1进行转化，在选择培养基上培养3
9、0d后，叶盘切口形成抗性愈伤组织，转化率为4-38；经NPT II酶活性分析和DNA分子杂交证实获得了转基因再生植株(王光清等，1994)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.1 植物基因转化的受体 8.1.6 其他受体,除了叶圆片、愈伤组织、悬浮细胞或原生质体等几种常见的受体之外，还有多种不同类型的组织或器官可作为外源基因的受体，如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等等。 如将切成小段形成一定伤口的金鱼草下胚轴与根癌农杆菌LBA4404(p35SGUSINT)共培养，通过不定芽途径获得抗G418的再生植株，经DNA/DNA斑点杂交
10、及GUS活性原位组织检测，初步证实外源基因 GUS已整合到金鱼草基因组并得到表达(余迪求等，1996)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质粒(Tumor-inducing plasmid)具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。,8 PLANT GENETIC T
11、RANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.2 Ti质粒的构建,利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。改造的目的有以下几点：（1）去除T-DNA区的激素基因。因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。（2）保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。,8 PLANT
12、GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.2 Ti质粒的构建,（3）在去除的 T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。（4）在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。（5）在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转
13、化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.3外源基因的转化,根癌农杆菌与烟草细胞原生质体共培养，再生了具有明显肿瘤特征的幼苗 (Marton等，1979)。Horsch(1985)等首创了根癌农杆菌与植物叶圆盘共同温育而实现转化的“叶圆盘共培养法”(Leef disk cocultivation)，实现了烟草的转化。李宝健等(1990)用此法已将外源基因转移到花椰菜、甘蓝、苜蓿、花叶芋、胡萝卜、番茄、烟草等细胞中并得到表达。另外，我国已在龙葵、大豆、甘蓝、菊花、诸葛菜等植物上通过农杆菌转化获得了转化植株。,8
14、PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,除Ti质粒外，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒(Root-inducing plasmid)也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用
15、次生代谢物质等。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.3外源基因的转化,一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导人了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化
16、频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.3外源基因的转化,对丝石竹幼茎中段、茎段切口、叶片和愈伤组织，用注射器针刺接种109个/mL发根农杆菌菌液。在含500g/L羧苄青霉素的MS基本培养基上25暗培养诱发毛状根。将从接种位点长出的毛状根剪成1-1.5cm小段，毛状根小段脱分化形成愈伤组织，在不含激素、蔗糖浓度2的培养基上可获得再生植株。冠
17、瘿碱检测结果表明毛状根、愈伤组织和再生植株都含有由发根农杆菌Ri质粒T-DNA编码合成的农杆碱和甘露碱。由此证明Ri质粒T-DNA被插入寄主细胞的核基因组中，当植株再生时被稳定地传递给子代(王敬文等，1992)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,例如：农杆菌叶盘法转化（主要操作） 一、无菌受体材料的准备 二、配制培养基预培养培养基 、共培养培养基、筛选培养基、生根培养基 三、受体材料预培养 四、农杆菌培养 五、侵染 六、共培养 七、选择培养 八、继代选择培养 九、生根培养,8
18、 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）,草类遗传转化过程,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,A.草地早熟禾的愈伤组织的间接诱导；B.胚性愈伤组织的诱导； C.愈伤组织的分化；D.组培苗的再生；E.抗性愈伤组织的筛选； F.转基因苗的壮苗和生根培养；G.转基因植株的再生,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.2基因枪转化法（Micropr
19、ojectile bombardment）,基因枪法又称微弹射击法，是由Klein(1987)等建立的。他们利用超声波使外源DNA液均匀地包裹钨弹(0.2-2.0m)，利用手枪的动力原理发射出微弹与DNA的复合体，击中靶细胞，穿透细胞壁和原生质体膜，为进一步整合到基因组提供机会，实现外源基因在完整组织中的表达。根据基因枪的动力原理，目前至少有6种不同类型的基因枪：火药基因枪、高压放电基因枪、压缩气体基因枪、粒子流基因枪、微靶点射基因枪和气枪基因枪。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATI
20、ON,8 植物遗传转化体系的建立,基因枪转化的操作包括以下6个步骤：（1）靶细胞或组织的预处理，主要是调节渗透压；（2）微粒子弹的制备，将外源DNA液包裹到金属颗粒上；金粉和钨粉是基因枪转化中最普遍采用的金属颗粒。钨粉比较便宜，但与DNA结合时间过长会催化性降解DNA并对某些类型细胞有毒害作用。金粉大小比较一致，不会引起DNA降解，对细胞也无毒害。（3）装备基因枪；（4）轰击；（5）过渡培养，在不加选择压的培养基上培养一两周，以利于靶细胞的恢复和外源基因的充分表达；（6）筛选培养或直接分化再生植株。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,基因
21、枪法已成为继农杆菌介导法之后的第二大基因转化方法，尤其在禾本科作物上应用更为广泛。例如： 美国康乃尔大学的Sanford(1990)利用“基因枪”把目的基因射入桃的胚胎愈伤组织、胚轴、子叶、茎尖和叶片，进行直接转化，并检测到GUS基因在这些组织中的瞬间表达。,基因枪曾成功地转化了小麦、玉米、水稻、兰花等单子叶植物和云杉等裸子植物，也曾将外源DNA导入线粒体和叶绿体中。目前存在的主要问题一是转化效率普遍较低；二是基因枪的造价高，转化成本也较高。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.3 聚乙二醇-介导法（PE
22、G-mediated transformation）,聚乙二醇(PEG)介导法与PEG诱导原生质体融合的机理相似，不同的是后者发生在原生质体之间，而前者发生在原生质体与DNA之间。在高浓度的二价钙离子(Ca2+)和高pH值的条件下，略带负电的高分子PEG可能促进 DNA向原生质体膜沉淀，或参与原生质体的内吞作用下，使外源DNA分子进入原生质体和细胞核，并整合到染色体上。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.3 聚乙二醇-介导法（PEG-mediated transformation）,Krens(1982
23、)等用这种方法首先实现了烟草的遗传转化。用PEG介导法转化诸葛菜子叶及下胚轴原生质体，系统研究了转化过程及其影响因素。以诸葛菜下胚轴原生质体为受体，PEG介导的主要步骤如下(周冀明等，1996)：（1）将下胚轴切成0.5mm小段，在CPW-13mol/L中质壁分离1h，于25- 28往复式摇床(45r/min)上酶解12h。（2）200目尼龙网过滤，500r/min离心5min，收集原生质体。同样条件下 CPW-9mol/L洗两次，沉淀的原生质体重新悬浮于2mLCPW-9mol/L中。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转
24、化的方法 8.2.3 聚乙二醇-介导法（PEG-mediated transformation）,（3）在10mL离心管中加入8mLCPW-21S溶液，再缓缓加入上述2mL原生质体悬浮液，离心5min(600r/min)。（4）小心吸出漂浮于溶液界面间的原生质体，重新用CPW-9mol/L离心洗涤一次，可得纯化原生质体。（5）将纯化后的原生质体以(2-5)106/mL的密度悬浮于1mLMaCa-1中10 min，加人25L质粒DNA静置10min，再加入PEG(相对分子质量6000)至终浓度13.3混匀，室温静置30min，轻轻混匀后静置10min。,8 PLANT GENETIC TRANS
25、FORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.3 聚乙二醇-介导法（PEG-mediated transformation）,（6）用MaCa-2稀释至10mL，离心收集，并用MaCa-2和原生质体培养基各洗一次，最后调整密度至5104/mL，28暗培养。（7）培养一定时间后分别向培养基中加入一定量的潮霉素进行筛选。研究结果表明，最适质粒量为25-30g，PEG浓度为15，pH值8.0。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.3 聚乙二醇-介导法（PEG-mediate
26、d transformation）,PEG法是进行基因直接转移的普遍方法，成本低廉，效果稳定。PEG法转化原生质体的频率虽然较低，但结合PEG融合细胞、高pH值、热激和原生质体同步处理等其他细胞工程技术的综合处理，可提高转化效率。其中的影响因素较多，如植物品种及其原生质体再生系统的效率，外源基因的浓度与构象，携带DNA，PEG溶液，加人PEG和DNA的顺序(先加DNA好)，介质中二价阳离子(Ca2+)的种类和浓度，转化细胞的筛选方法等。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2 植物基因转化的方法 8.2.4 其他转化方法 8.2.4.1
27、电激法(Electroporation),电激法是采用高压直流电脉冲的“电激穿孔”作用打开原生质膜，促进细胞膜吸附的DNA进入植物原生质体。电激法转化能有效地将外源DNA导入植物细胞，而且不影响原生质体再生植株的过程。Fromnn(1985)首次通过电激穿孔法，将外源CAT基因导人玉米、胡萝卜、烟草的原生质体并表达。Shimanoto(1989)和Rhodes(1988)利用电激法实现了水稻和玉米原生质体的转化。Choudhary(1998)用电穿孔法转化矮牵牛原生质体的结果表明，当电压为 1 000V/cm时，GUS活性最高。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8
28、 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.2显微注射法(Microinjection),这是利用特制的显微注射仪直接将外源遗传物质注入植物细胞的转化方法。该方法虽然每次只能注射少量的受体细胞，但其转化的成功率高，而且可以省去选择性标记的麻烦。最好选用原生质体作为受体，并且需要预先固定才能注射。科学家最近提出了一种固定、注射和培养植物原生质体的完整方法。在盖玻片上放一小尼龙环，环内填满含有琼脂糖凝固的培养基；在中央滴1L含有原生质体的琼脂糖微滴，使每个微滴中只含5-15个原生质体。然后对原生质体做显微注射操作，每小时可注射约50个原生质体。经注射过的原生质体微滴可以直接培养
29、，并再生植株。显微注射法应用于花粉或其他胚胎类组织可能有更好的应用价值，这样可克服用原生质体带来的培养上的困难。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.2显微注射法(Microinjection),用显微注射法将外源基因导入含12个细胞的油菜小孢子原胚，80的注射胚再生植株，转基因植株的频率高达51，尽管难于注射每个细胞，但通过形成次生胚，嵌合现象得到解决(Neuhaus等，1987)。我国学者建立了用微量注射法将外源DNA导入胚组织的技术。外源海岛棉DNA导入陆地棉和中棉，获得了变异的后代；还将抗病棉基
30、因导人高产、优质的感病品种中，获得了抗病、优质、高产的棉花新品种(黄骏麟等，1985)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.3 花粉管通道法(Pollen-tube pathway),周光宇等(1983)首创的花粉管通道法，是将外源DNA的片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这种方法开创了整株活体转化的先例，在改良农作物的遗传特性上有很大的潜力。已经实现了外源DNA对水稻、小麦、棉花、油菜等作物的转化。,8 PLANT GENETIC T
31、RANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.3 花粉管通道法(Pollen-tube pathway),De La Pena等(1987)将外源DNA直接注入黑麦的幼花序中，并获得了转基因植株。谢永祥等(1995)采用花粉管法，以含有GUS和NPT II基因的pRT99gus质粒转化蝴蝶兰，转基因幼胚及幼苗GUS活性的组织化学分析表明，已获得部分的转化证据。PCR和Southern杂交分析表明，授粉后30d左右注射DNA，可得到较高的转化效率。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4
32、 其他转化方法 8.2.4.3 花粉管通道法(Pollen-tube pathway),花粉管通道法的特点是直接操作于整体植株，参与了被转化植物的生殖过程，避开了从细胞到组织的培养，并能与常规育种技术相结合且操作简单，经济适用。由于目前对高等植物基因表达调整的研究较少，没有完全达到定向改变某一性状的水平，加之对基因与性状的联系所知有限，因此，这种转化方法不失为一种改变作物遗传性、培育优良品种的可行方法。但是不足之处是，花粉萌发时柱头释放的核酸酶会破坏外源DNA，同时由于花粉管欲进入合子还需要通过重重屏障，因而花粉管通道转化法的转化频率较低。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMA
33、TION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.4脂质体转化(Liposomes transformation),脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结构，一直被作为生物膜模型从结构和功能上进行研究。由于脂质体内能够包装许多大分子如病毒、核酸和染色体，并能转入植物细胞，所以，开展了以脂质体作为植物细胞遗传工程载体的广泛研究。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.4脂质体转化(Liposomes transformation),脂质体进入原生质体可能有如下的机理：
34、（1）内吞作用：脂质体靠近原生质体，原生质体内陷，逐渐将脂质体吞入原生质体。（2）融合作用：脂质体膜与原生质体膜互相交换脂类，在此过程中使内含物或脂质体进入细胞内。此时一般需要加人PEG或二价阳离子。（3）交换作用：脂质体膜与原生质体膜互相交换脂类，在此过程中使内含物进入细胞。进入细胞的脂质体与溶酶体融合，并逐渐被降解，使内含物释放出来。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.4脂质体转化(Liposomes transformation),利用脂质体转化植物原生质体的主要步骤如下：（1）制备植物原生质体
35、。（2）制备脂质体：有超声波法、机械振荡法、透析法、融合法、注射法和逆向蒸发法等。超声波法可制备单层小囊泡脂质体，而逆向蒸发法可产生单层大囊泡脂质体。（3）将脂质体与原生质体共培养：将0.5mL脂质体和1mL植物原生质体混合于试管中，加入融合培养基；在37下缓慢振荡30min，然后加入融合剂 PEG，混匀后培养15min，用培养液冲稀并洗涤，离心收集原生质体。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.4脂质体转化(Liposomes transformation),脂质体作载体在植物细胞工程中已有广泛的研究
36、。用脂质体包装带有抗药性标志的、编码氨基糖苷磷酸转移酶嵌合基因的质粒DNA，用PEG诱导该脂质体与烟草原生质体融合，获得的转基因再生植株具有抗性和转化基因的酶活性，种子能在含有药物的培养基上正常地萌发、生长，转化基因能随种子传递到后代，并遵循孟德尔遗传规律。脂质体作为载体，能保护细胞内部的遗传物质；与植物细胞相互作用时毒性很小；受体范围广，对原核和真核细胞均适用；制备脂质体比其他质粒载体容易，价格低廉。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.5激光微束转化法(Laser microbeam punctur
37、e),激光微束穿刺技术是利用激光微束在受体植物细胞上穿孔，通过细胞内外的渗透压差将外源基因直接导入带壁的植物细胞内。该法具有很多的优点：（1）操作简便。受体植物只需经过简单的短时间高渗预处理即可置于加入一定量外源基因的Rose小室中进行激光照射。（2）受体植物材料广泛，不受转化方法的限制，且转基因植株筛选过程更为容易。（3）激光微束仪装有显微摄像系统，可以直观地观察打孔部位并准确定位于受体细胞的某一部位及细胞器上，对植物伤害小。（4）转化率高，适应性广，重复性好。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.2.4 其他转化方法 8.2.4.5
38、激光微束转化法(Laser microbeam puncture),利用激光微束穿刺法已将pBIl21质粒DNA导入百脉根。首先，用高渗缓冲液对子叶进行预处理，然后用激光微束穿刺子叶细胞，接着在卡那霉素培养基上筛选具有抗性的绿色小苗。转化植物在卡那霉素浓度为100g/mL条件下筛选培养3代后，获得4株转基因植物，DNA PCR扩增分析均为阳性，证实 GUS基因已导人百脉根中(周奕华等，1997)。利用此方法也已将菜豆几丁质酶基因导人油菜中 (杨仲毅等，1998)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3 转基因植物再生及其检测 8.3.
39、1 转基因植株再生,植株再生是基因转移的关键步骤，直接决定能否获得转基因植株。转基因植株的再生一般分为两种形式：一种是愈伤组织再生，转化后的外植体首先发生愈伤组织，然后在分化培养基上诱导出芽直至长成一个完整的植株，这是植株再生中最常用的一种方式。下面就以红豆草为例介绍胚状体的诱导和再生(刘瑞凝，1993)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,（1）取红豆草无菌苗的下胚轴，在无菌条件下切成3-4cm的小段，置于固体培养基上。培养基为MS+3蔗糖+0.8琼脂+6-BA 2.5mg/L+IAA lmg/L及MS+3蔗糖+0.8琼脂+6-BA 2
40、mg/L +IAA lmg/L。（2）外植体于22下进行暗培养，三四周后选择黄色愈伤组织，在MS+3蔗糖+0.8琼脂+2,4-D 0.5-2 mg/L继代培养基上进行重复培养，条件同上，每3周转移一次，会发生黄色颗粒状愈伤组织，即成型胚状体。（3）用整体染色与透明技术，在倒置显微镜下观察各个时期胚状体的发育情况，可看到从众多的球形胚、心形胚到子叶的连续变化过程。（4）将胚状体转移到无激素的MS培养基上约1.5个月以后，均不同程度地分化出正常苗及畸形苗。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3 转基因植物再生及其检测 8.3.1 转基因植
41、株再生,另一种是直接再生，从外植体直接诱导出芽而不经过愈伤组织的分化。诸葛菜子叶在MS+BA 3 mg/L十NAA0.2 mg/L培养基上光照培养，将分化出来的小苗从基部切下，插人生根培养基1/2MS+IBA0.03 mg/L中生根，建立了诸葛菜组织培养高频率再生系，其再生率可达100。他们采用根癌农杆菌转化子叶，附加一定量的氨苄青霉素、头孢霉素和卡那霉素的相应培养基上进行筛选，进而培养出再生苗。转化子叶的芽再生率为51，获得完整转基因植株的转化率为5.53(周冀明等，1996)。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,转基因植株再生的方式与
42、一般植株再生的方式相同，其中的主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、抗生素、转化过程的影响。另外，因受体系统不同，转基因植株再生的方式也是不同的(见表)。 转基因植株再生一览表,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3 转基因植物再生及其检测 8.3.2 转基因植株的检测,当带有目的基因的嵌合基因被转入某种受体系统(细胞或组织)后，必须对转基因植物材料进行分析与鉴定，以确定外源基因是否在转基因植物中正常表达。在建立植物遗传转化体系时，常采用报告基因作为标记，以便快速检测。对转基因植株中目的基因的表达主要采用分子生物学方法检测，包
43、括 Southern杂交、Northern杂交、Western杂交和聚合酶链式反应(PCR)等方法。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3 转基因植物再生及其检测 8.3.2 转基因植株的检测 8.3.2.1 报告基因,报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因 (见表)。具有如下特点：第一，可利用抗菌素抗性报告基因在受体细胞内的表达和选择压力，从包含大量非转化克隆的受体细胞中选择出转化细胞系；第二，可以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况；第三，可把经过不同改造的调控区与报告基因相
44、连，观察报告基因的表达情况测知基因调控序列，用于研究植物基因的调控。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,常见的报告基因,不同的报告基因需要采取不同的检测方法。如组织化学法是检测GUS基因最方便的方法。其中最常用的底物是X-Gluc。在GUS活性作用下，X-Gluc水解产生的无色吲哚衍生物发生氧化二聚作用，形成蓝色沉淀。具体操作步骤为：（1）将转化的植物材料中放入适量的固定液，室温下温和摇动30-60min；（2）用50mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)洗10-15min，重复几次，除去固定液； （3）将植物材料放入X-Gluc染色液中，真空抽滤5min，37保温
45、24h；（4）若需催化氧化，可在染色液中加入终浓度为1 mmol/L的铁氧化钾或亚铁氰化钾溶液；（5）将材料用70的酒精多次洗涤，除去叶绿素；（6）显微镜下观察。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,园艺学报，2004，31（6）：737-742”应用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因优化辣椒的遗传转化体系”,1.对照 2.转化位点表达荧光 3.表达荧光的愈伤组织 4.表达荧光的芽,8 植物遗传转化体系的建立,8.3 转基因植物再生及其检测 8.3.2 转基因植株的检测 8.3.2.2 Southern杂交法,
46、这是Southernl975年发明的方法，其原理是利用两条单链DNA的碱基互补性，来检测外源DNA的转化结果。 此方法是验证转化基因是否存在于被检测植株的最常规的手段，但不能得到基因是否表达的信息。外源基因往往由于沉默而不能表达，要获得基因表达的信息，还要通过mRNA和蛋白质的检测以及表现型的鉴定。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3.2.2 Southern杂交法,具体操作步骤如下：（1）提取转基因植株的DNA片段，用限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳； （2）将凝胶放入碱性溶液中使DNA解离为两条单链；（3）在凝胶上贴盖硝酸
47、纤维素膜，使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上； （4）将此膜置于含有同位素标记的核酸探针的杂交液中反应； 按照碱基配对原则，如果被检DNA片段与核酸探针具有互补序列，就能在被检的DNA区带部位结合成双链的杂交分子；（5）通过放射自显影，可以观察到与探针DNA互补杂交的片段。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3.2.3 Nothern杂交,植物基因的表达主要是在转录水平上调控的。Northern杂交技术是由A1- wine等(1977)首先建立的，用于检测外源基因转录出来的mRNA。其原理是把RNA转移和固定到特定的膜上，
48、用特定的DNA探针来探测RNA。在一定的离子强度和温度下，DNA分子可以和具有同源性的单链RNA互补而形成RNA-DNA异质双链；然后通过放射自显影显示出来。Northern杂交的步骤与 Southern杂交基本相同，只是单链DNA换成了RNA，所以不需变性处理。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3.2.4 Western杂交,Western杂交是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上，然后对固定化蛋白质进行免疫学测定。是根据蛋白质 (抗原)可以和该蛋白质的特异抗体相结合的原理而进行的。将硝酸纤维素膜
49、上的蛋白质区带与同位素标记的抗体进行抗原-抗体反应；如果被检测的蛋白质中具有相应的抗原，则同位素标记的抗体即被结合到膜上的相应区带，并通过放射自显影显示出来。由于抗原-抗体的反应是特异性很强的反应，因此，蛋白质技术现已成为分析基因在蛋白质水平上的表达及重组基因功能的一个重要手段。通过蛋白质杂交技术，可以验证转化基因是否在蛋白质水平上正常表达。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3.2.5聚合酶链式反应(PCR),PCR是一个简便快速的体外合成DNA的方法，可在一种高温DNA聚合酶的作用下，通过引物和模板DNA来扩增DNA。模板可以是基因组DNA、单链 DNA、克隆DNA序列或cDNA。新合成的双链被高温处理变性后成为两条新的单链，当有引物和聚合酶存在时，两条单链又作为模板而合成两条双链DNA；多次反复变性、合成后，某一DNA片段就可以扩增无数倍而被检测出来。根据有价值的转化基因的序列或报告基因的序列设计引物，通过转基因植株基因组的PCR结果，就可检验外源基因在转化植物中的表达情况。,8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION,8 植物遗传转化体系的建立,8.3.2.5聚合酶链式反应(PCR),
