1、抗体酶 (Abzyme),抗体酶(Abzyme),概念:抗体酶 或催化抗体(Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂,是一种具有催化功能的抗体分子,在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果,是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。,科学家们设想:如抗体能专一地识别某化学反应的过渡态,它应能利用其结合能降低该反应的活化能,从而像酶一样催化该化学反应加速进行。抗体酶技术中研究得最广泛的是酯水解反应。人们用与某些酯类水解反应之过渡态结构相似的化合物作为半抗原来生产单克隆抗体。由于单克隆抗体的特点是专一性强,设想这种抗体的结合位点应当契
2、合该水解反应的过渡态结构,使其稳定在过渡态,进而催化其水解。,结果按这种设想所得到的抗体不仅使酯的水解速度增加了103104倍,而且还具备专一性、 pH依赖性及被抑制剂抑制等酶的基本特性。抗体酶的催化活性虽然仍比天然酶小,但这意味着可按人的意愿来设计和生产具有已知结合专一性的蛋白质,在理论上和实践上均有重要意义。美国已将抗体酶技术商品化,在第一批具有应用价值的抗体酶中有与蛋白酶相似的抗体,可在特定的氨基酸序列上切割蛋白质,从而建立具有各种专一性的切割蛋白质抗体酶库,就像限制性核酸内切酶库一样供研究者选用。,有一种抗体酶可切开血纤维蛋白(血凝块的主要成分),可能用于治疗心脏病时溶解血凝块。另一些
3、抗体酶可固定在癌变细胞突出的蛋白质上,破坏癌细胞膜,因而将用于治疗癌症。还有些抗体酶可识别并破坏病毒中氨基酸连接所形成的特殊片段,从而防止病毒与靶细胞结合。有机合成化学家可望利用抗体酶技术提供新的催化剂,使那些现在还不能利用天然酶催化的复杂反应实现酶催化反应。,免疫球蛋白的结构与功能,1抗原(antigen)抗体(antibody)的一般概念,2、免疫球蛋白结构(1) 一级结构(2) 空间结构,抗原和抗体当外源物性物质,如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒(细菌、细胞、病毒)进入人或动物体内时,机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白(immune globin),并以之结合,以消除异
4、物的毒害。此反应称为免疫反应,此异物便是抗原,此球蛋白便是抗体。,免疫球蛋白IgG的一级结构,IgG的三级结构,IgG与抗原形成 的交联晶格,抗体酶具有典型的酶反应特性;与配体(底物)结合的专一性,包括立体专一性,抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性;具有高效催化性,一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104108倍,有的反应速度已接近于天然酶促反应速度;抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。,一、抗体酶的催化特征,特征 1、与天然酶相比抗体酶的特点能催化一些天然酶不能催化的反应有更强的专一性和稳定性催化作用机制不同 2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较更高的反
5、应特异性反应的可逆性反应的量效性反应过程,二、抗体酶的催化作用机理,1、过渡态理论与抗体酶 2、抗体酶催化的三种重要反应机制水解作用机制基团转移连续反应机制 3、抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应 : 抗体酶在有机溶 剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应 ;有机溶剂引起脱 羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应 :在疏水溶剂 中,活性较高。,若抗体能结合反应的过渡态,理论上它则能够获得催化性质,以过渡态类似物作为半抗原,则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象,这种抗体与底物结合后,即可诱导底物进入过渡态构象,从而引起催化作用。根据这个猜想列那和苏尔滋(PCSchultz)分别领导各自的
6、研究小组独立地证明了:针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体,能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年美国Science杂志同时发表了他们的发现,并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。,三、抗体酶的催化反应类型,1、转酰基反应 2、水解反应 3、Claisen重排反应 4、酰胺合成反应 5 Diels-Alder反应 6、转酯反应 7、光诱导反应 8、氧化还原反应 9、脱羧反应 10、顺反异构化反应 包括天然生物催化剂不能催化的反应,甚至可以使热力学上无法进行的反应得以进行。,酰基转移反应,Claisen 重排 反应机理Claisen 重排是个协同反应,中间经过一个环状过
7、渡态,所以芳环上取代基的电子效应对重排无影响。 Claisen重排是分子内的重排。,反应实例Claisen 重排具有普遍性,在醚类化合物中,如果存在烯丙氧基与碳碳相连的结构,就有可能发生Claisen 重排。,氧化还原反应,金属螯合反应,磷酸酯水解反应,磷酸酯闭环反应,光诱导反应,a.光聚合反应(二聚作用),b.光裂解反应,Diels-Alder反应是20世纪有机合成方面最主要的发现之一,也是有机化学中非常重要的一类反应。所谓Diels-Alder反应是指含有共轭二烯结构的双烯体和含不饱和键的亲双烯体,通过1,4-加成得到环状烯烃,故又称为双烯合成反应。Diels-Alder反应的本质是双烯体
8、和亲双烯体发生4+2环加成,其历程是协同进行的周环反应。由于Diels-Alder反应在有机化合物的分离、鉴别以及合成中应用广泛,所以吸引了人们从反应机理、反应条件以及可发生的范围等多方面进行着不断深入地再研究,其它名称二烯合成 4+2环加成,反应可逆,环己烯衍生物,亲二烯体 dienophiles,二烯 dienes,有利因素:,(给电子基),(吸电子基),Diels-Alder反应机理,六员环过渡态,协同机理,一些简单的Diels-Alder反应例子,环戊二烯二聚体,四、抗体酶的制备,1、细胞融合法:用设计好的半抗原,通过间隔链与载体蛋白(如牛血清白蛋白)偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫
9、,使宿主有机体针对抗原产生抗体,产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞(干细胞)相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化,即能产生单一均匀的抗体。,2、抗体结合位点化学修饰法:抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性,易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点,3 . 引入辅助因子法很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶,成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因
10、子,所用半抗原分子带有一肽键。且通过羧基及仲胺基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体,在金属离子复合物作为辅因子的参与下,这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键 .,用生物工程的方法产生抗体酶 借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上,使其获得催化功能 Fab片断由轻链和重链的VH及CH1部分组成,作为一种催化剂,抗体酶有这样的片断就行,无须完整的抗体分子。从人或动物的抗原中抽取基因,然后用酶反应复制基因的聚合酶链反应(PCR)技术重新铸造轻链和重链,这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。这些基因库是存储
11、在细菌病毒里,通过随机地将基因和轻重链结合的方法,就可大量制造Fab片断了。片断里的基因是通过细菌的形式表达出来的。这就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体。,5、拷贝法:用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体,再将此抗体免疫动物并进行单克隆化,获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选,获得具有原来酶活性的抗体酶。 6、共价抗原免疫法这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备方法。以亲和标记剂为半抗原,则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团,如亲核性,亲电性氨基酸,酸性氨基酸,碱性氨基酸等。,五、抗体酶的筛选 1、ELISA法;用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单克隆抗体 。 2、酶
12、学活性检测法:直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。 3、短过渡态类似物法:以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。 4、基因筛选法 :应用基因探针,对基因抗体库进行分析和筛选。,酶 联 免 疫 分 析,酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)是将酶作为标记物质,使之和抗原(或抗体)结合形成酶与抗原(或抗体)复合物,然后再根据待测抗体(或抗原)与复合物专一且定量的结合关系,通过测定待测抗体(或抗原)结合的标记酶活力,从而计算出抗原或抗体的量。,酶标免疫分析示意图,六、抗体酶的应用前景 1、 抗体酶在帮
13、助戒毒方面的应用 Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原,产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多,水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此,用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾,达到戒毒目的 。,2.抗体酶用于肿瘤治疗 目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗(ADEPT)技术,即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联,这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后,当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近,抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物,从而提高肿瘤细胞局部药物浓度,增强对肿瘤的杀伤力,达
14、到提高肿瘤化疗效果的目的。当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解,抗原还要尽量减少免疫原性 。,抗体酶的研究,为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质,即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性,可以得到一系列高度专一性的抗体酶,使抗体酶不断丰富。随之出现大量针对性强、药效高的药物。立体专一性抗体酶的研究,使生产高纯度立体专一性的药物成为现实。以某个生化反应的过渡态类似物来诱导免疫反应,产生特定抗体酶,以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解,从而防止病毒与靶细胞结合。抗体酶的固定化已获得成功,将大大地推
15、进工业化进程。,用人工方法合成的抗体酶,可作为研究酶作用机理的有力工具,用于催化大量天然酶不能催化的立体专一性反应,更为开发具有高度选择性的药物指明了方向。,存在的问题,尽管抗体酶研究取得了很大进展,离开实际应用仍有一段距离。首先是催化效率问题: 目前所得的大部分催化抗体的反应速度只能是中等水平的, 比酶催化低 23 个数量级;因此,如何提高抗体酶的催化效率是个挑战。其次是筛选问题:目前的筛选方法只能筛选库中有用抗体的一小部分;一般是通过对半抗原结合力的大小来筛选的,而不是通过催化活性来筛选,可是对半抗原亲和力最大的不一定是最好的催化抗体相信正在开发的catELISA 法能够解决这一问题。还有抗体酶专一性、底物抑制、催化基团最适装配等问题 都亟待人们去攻克。 抗体酶是抗体与酶结合的产物,它的发展有赖于抗体与酶的结构的深入研究,特别是对酶作用机制的深入研究这一方面还有待人们努力,