1、http:/ ,真菌感染检验,上海交通大学医学院,讲课内容,标本的采集、运送和保存,浅部感染真菌检验,真菌感染检验,按其侵犯人体组织和器官的不同，临床上将真菌分为引起皮肤和软组织感染的真菌和引起侵袭性感染的真菌两大类。皮肤和软组织感染的真菌，又称为浅部真菌（superficial fungi），主要侵犯机体皮肤、毛发和指（趾）甲，寄生和腐生于表皮、毛发和甲板的角质组织中。深部感染真菌主要侵袭深部组织和内脏以及全身。,上海交通大学医学院,临床标本真菌检验程序,上海交通大学医学院,真菌鉴定程序,上海交通大学医学院,标本的采集、运送和保存,合适采集、运送与处理标本以及遵守真菌实验检测与鉴定程序是保证
2、真菌感染的实验检测结果正确的前提。 所有标本均应在密封无菌容器运送和处理，运送时间越短越好；不能用厌氧转运或厌氧容器。粪便不推荐作为真菌检验的标本。,上海交通大学医学院,标本,毛发、皮屑、指（趾）甲 脓液、伤口、创伤及软组织 血液、骨髓 导管头 结膜、角膜刮片、玻璃体、前房穿刺液 前列腺液、阴道分泌物 尿液 下呼吸道标本（痰、支气管肺泡灌洗液、支气管保护性毛刷） 上呼吸道标本 无菌体液（脑脊液、心包液，腹膜液和滑膜液） 组织,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,上海交通大
3、学医学院,上海交通大学医学院,2018/10/15,17,浅部感染真菌检验,浅部感染真菌包括表面感染真菌、皮肤癣真菌和皮下组织感染真菌三类。 临床上最多见的为皮肤癣真菌，包括毛癣菌属、表皮癣菌属和小孢子菌属。,2018/10/15,18,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌,（一）分类和命名 皮肤癣菌（Dermatophytes）是一类嗜角质的丝状真菌，具有无性期和有性期两种形态。大多数从环境和人体分离到的菌株处于无性期，属于丛梗孢科。按菌落特征及大分生孢子的形态将皮肤癣菌分为3个属，即毛癣菌属(Trichophyton )、 小孢子菌属(Microsporum ) 及表皮癣菌属(Epidermophy
4、ton)。 有性期属于裸囊菌科、节皮菌属(Arthroderma)。皮肤癣菌种类见下表,2018/10/15,19,浅部感染真菌检验,2018/10/15,20,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌,（二）临床意义 毛癣菌属易侵犯人体皮肤、指（趾）甲、毛发的角蛋白组织并生长繁殖，可引起头癣、体癣、股癣、叠瓦癣、手癣、足癣及甲癣等。 皮肤癣菌是接触传染，不论男女老少，只要反复接触患者均有可能被感染。 引起皮肤和软组织感染的真菌痊愈，但痊愈后仍可再感染皮肤癣菌。少数过敏体质的皮肤癣病患者可出现过敏反应，表现为癣菌疹。,2018/10/15,21,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌,（三）真菌检验 1.标本的采集、运
5、送和保存 1）甲标本 采集标本前用75%乙醇彻底清洁病甲，以减少培养时的细菌污染，提高镜检的阳性率。钝刀用高压或者火焰灭菌，从甲的变色、萎缩或变脆部位、健甲与病甲的交界处取材，保证一定量与一定深度标本。甲标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养，甲标本应尽量剪碎后接种。对于伴有甲沟炎患者的取材，应采用棉拭子，75%乙醇清洁局部后沾取损害分泌物，每位患者至少应取两个拭子，放入无菌试管中以备镜检和培养。,2018/10/15,22,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌,（三）真菌检验 1.标本的采集、运送和保存 2）皮屑标本 采集标本前用75%乙醇清洁取材区域。用高压或者火焰灭菌钝刀，从损害的边缘向外刮取或用剪
6、刀剪去疱顶。如果鳞屑量较少或婴幼儿患者，可采用粘着透明胶带或粘着皮肤采样送检，将透明胶带粘着面紧压于损害之上，然后剥下，将粘着面向下贴在透明载玻片上送检。皮屑标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养。,2018/10/15,23,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌,（三）真菌检验 1.标本的采集、运送和保存 3）毛发标本 选择适当的毛发，应检测那些无光泽毛发或断发以及在毛囊口折断的毛发。先将镊子高压灭菌，用镊子将毛发从头皮拔除。不应去掉毛根部。如果怀疑头皮隐性感染，可用塑料梳子刷头皮后将其压在琼脂表面进行培养。毛发标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养。,2018/10/15,24,浅部感染真菌检验-皮肤癣
7、菌,（三）真菌检验 2.常用检验方法 1）直接显微镜检查 【操作】皮屑标本用 10 KOH液；甲屑用 25 KOH液或25NaOH液含5甘油处理后制成涂片；病发置载玻片上，加10%KOH微加温使角质溶解。直接镜检或棉蓝染色后镜检。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。 【结果判定】皮肤癣菌感染在皮屑、甲屑镜检时可见有隔菌丝或成串孢子,病发可见发内孢子或发外孢子； 【注意事项】掌握真菌菌丝或孢子判定标准，即具有一定折光性的为菌丝或孢子，勿将纤维、细胞等误认为真菌。,2018/10/15,25,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌,（三
8、）真菌检验 2.分离培养 分离培养的目的在于鉴定真菌的菌种。 【操作】真菌小培养法参见深部真菌标本 【结果判定】 1.真菌生长后观察菌落的以下方面 生长速度；菌落大小：以mm或cm记录菌落直径；表面形态： 菌落性质；菌落颜色；菌落边缘；菌落底部 2. 显微镜下观察 高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列依据菌落特征，镜检特点，尤其是大分生孢子形状及特殊形状菌丝，必要时辅以鉴别试验鉴定皮肤癣菌。,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌鉴定,皮肤癣菌菌种鉴定主要依靠培养的菌落特征、显微镜下孢子和菌丝的形态以及生理生化试验。 其中关键在于促进皮肤癣菌产生孢子，对于难于产孢的菌种需要采用特殊培养基诱导
9、产孢，例如：对于怀疑毛癣菌属可以采用燕麦培养基，对于怀疑小孢子菌属可以采用米饭培养基。 个别上述方法均难以鉴定菌种需要借助分子生物学方法鉴定。 皮肤癣菌试验培养基（dermatophyte test medium ,DTM）用于皮肤癣菌筛选。皮（甲）屑与毛发标本接种该培养基，随着皮肤癣菌生长，1周内培养基由黄色转变为红色。培养基中大豆蛋白胨提供营养，放线菌酮抑制腐生霉菌，氯霉素抑制革兰阳性菌和庆大霉素抑制革兰阴性菌。镜下很容易识别皮肤癣菌的形态特征。,上海交通大学医学院,2018/10/15,27,浅部感染真菌检验-皮肤癣菌鉴定,1.毛癣菌属 在SDA（加CCG）上27+1培养，毛癣菌属菌落生
10、长速度慢到中等；质地光滑到毛状；表面呈白色、黄色、米黄色或红紫色，背面呈苍白色、黄色、褐色或红褐色。显微镜下大分生孢子呈多细胞、圆柱状、棒状或香烟形，壁光滑，常缺乏。小分生孢子呈单细胞、圆形、梨形或棒形，孤立或像葡萄状群生。有时存在关节型孢子和厚膜孢子。,2018/10/15,28,毛癣菌：菌落灰白、红、橙或棕色,表面呈绒毛状、粉粒状或蜡样。大分生孢子细长棒状薄壁。菌丝有螺旋状、球拍状、鹿角状和结节状,毛癣菌属(Trichophyton ),上海交通大学医学院,2018/10/15,30,浅部感染真菌检验鉴定,2.小孢子菌属(Microsporum ) 菌落生长慢到快；质地光滑、毛状或羊毛状；
11、表面颜色呈白色、米黄色、黄棕色、黄色或锈色，背面呈苍白色、黄色、红色、褐色或红褐色。显微镜下大分生孢子呈梭形，壁薄或厚，有棘状突起，孤立，含225个细胞。小分生孢子单细胞，卵圆形到棒形，孤立。,2018/10/15,31,小孢子癣菌：菌落为灰色、橘红色或棕黄色，厚壁大分生孢子，菌丝有结节状、梳状和球拍状,(Microsporum ),2018/10/15,32,浅部感染真菌检验鉴定,3.表皮癣菌属(Epidermophyton) 菌落生长缓慢；质地膜状变成毡状到粉状；表面呈黄色到土黄色，背面呈羚羊皮色到褐色，中心有不规则皱襞或脑回状沟。显微镜下大分生孢子丰富，棒形、顶端钝圆、壁薄、光滑、孤立或
12、成群，形成在菌丝侧壁或顶端，23个一组。无小分生孢子，在成熟菌落中形成大量厚壁孢子。,2018/10/15,33,表皮癣菌：菌落初为白色鹅毛状,以后变为黄绿色粉末状。粗棒状薄壁大分生孢子。菌丝球拍状,(Epidermophyton),2018/10/15,34,浅部感染真菌检验,角层癣菌 角层癣菌主要寄居于人体皮肤和毛干的最表层，因不接触组织细胞，很少引起宿主组织细胞的炎症反应，即使有也极轻微。临床主要有糠秕马拉癣菌（Malassezia furfur）、何德毛结节菌（Piedraia hortae）和白吉尔丝孢酵母（Trichosporon beigelii）。,糠秕马拉癣菌（Malasse
13、zia furfur）,糠秕马拉癣菌主要寄居在人体皮肤和毛干的最表层，可在健康人皮肤上分离到，为条件致病菌。 侵入表皮后，在皮肤角质层外2/3处生长、繁殖，引起一种慢性、无症状或轻微症状的皮肤斑疹，呈灰白色、褐色或淡黄色，上面附着细小糠皮样鳞屑，有时可融合成片，似汗渍斑点，俗称汗斑即花斑癣（tinea versicolor）。皮损最常见于胸、背、臂的上半部皮脂腺丰富部位。病程缓慢，多年不愈，对健康无碍，但影响美观。油性皮肤易感，而且与遗传、免疫缺陷等因素有关，诱发因素为高温多汗。近年大量研究显示，糠秕马拉癣菌还可引起毛囊炎，可能为脂溢性皮炎的重要发病原因之一。,上海交通大学医学院,糠秕马拉癣菌
14、（Malassezia furfur）,真菌检验 1.标本采集 疑似汗斑癣：病损极为表浅，以钝手术刀取材时应尽可能刮取表面皮屑，或用双面胶粘贴于皮肤表面，数分钟后揭下，直接移至载玻片上。有时可借助Woods灯照射呈金黄色荧光处取材。疑似毛结节癣：取带有结节的病发、胡须。,上海交通大学医学院,糠秕马拉癣菌（Malassezia furfur）,真菌检验 2.直接显微镜检查 将取材的胶带直接贴于载玻片上镜检或经棉蓝染色或革兰染色后检查，皮屑加10%KOH制片、观察。如果是糠秕马拉癣菌感染，可找到弯曲或弧形的菌丝及圆形或卵圆形孢 子。 病发置载玻片上，加10%KOH微加温使角质溶解，直接镜检或棉蓝染
15、色后镜检。何德毛结节菌引起的感染可见：菌丝分枝、棕色，菌丝分隔形成关节孢子，并可见子囊，每个子囊内含24个新月形子囊孢子。白吉尔丝孢酵母菌引起的感染可见：菌丝淡绿色，与毛干垂直，分裂为圆形、卵圆形或长方形的孢子，无子囊及子囊孢子。,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,糠秕马拉癣菌（Malassezia furfur）,3.分离培养 疑似花斑癣的鳞屑标本接种于含氯霉素、放线菌酮及植物油的沙氏培养基上，35培养，观察菌落。疑似毛结节癣的病发接种于含放线菌酮的沙氏培养基上，29培养，观察菌落。 4.鉴定 糠秕马拉癣菌的主要特征是：病损皮屑Woods灯照射呈金黄色荧光，嗜脂性生长，酵母型菌落，腊肠
16、样菌丝，厚壁孢子。根据病发上结节的颜色、硬度、大小，即可对何德毛结节菌和白吉尔丝孢酵母菌初步诊断，直接镜检看到子囊或子囊孢子，可确定为何德毛结节菌。,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,2018/10/15,41,浅部感染真菌检验,皮下组织感染真菌 引起皮下组织感染的真菌主要有着色真菌和孢子丝菌。这些菌广泛存在于土壤、腐木、农作物、柴草、花卉等，常因外伤时乘机植入引起感染。侵入人体后，在真皮深层、皮下组织生长繁殖，感染一般仅限于局部，亦可缓慢向周围组织扩散。,2018/10/15,42,浅部感染真菌检验,皮下组织感染真菌 主要病原菌有裴氏着色真菌(Fonseceea pedrosoi)、紧
17、密着色真菌(Fonseceea compacta)、卡氏枝孢霉（Cladosporium carrianii）和疣状瓶霉(Phialophora verrucosa)等， 孢子丝菌属半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、丛梗孢科。主要病原菌为申克孢子丝菌（Sporotrichum schenckii）。,浅部感染真菌检验检验 申克孢子丝菌（Sporotrichum schenckii）,一直以来人们认为孢子丝菌病仅由申克孢子丝菌（S. schenckii）这一菌种感染所致。近年来，随着分子生物学鉴定方法的发展，发现申克孢子丝菌其实为由一组不同种系构成的复合体，即申克孢子丝菌复合体（S.schenck
18、ii complex），包括S. schenckii，S.brasiliensis，S. globosa和S. Luriei等。,上海交通大学医学院,浅部感染真菌检验 申克孢子丝菌（S. schenckii）,鉴定 标本革兰或PAS染色制片在油镜下直接镜检可见到革兰阳性的长圆形雪茄烟样或梭形小体，一般4m6m大小，有时为4m8m，但阳性率很低。申克孢子丝菌复合体其中包含的不同菌种可以通过形态学及生理学特点结合分子生物学分型手段进行鉴定。,上海交通大学医学院,浅部感染真菌检验 申克孢子丝菌（S. schenckii）,上海交通大学医学院,2018/10/15,46,深部感染真菌检验,深部感染真菌
19、因常引起全身性感染又称为系统性感染真菌，包括致病性真菌和条件致病性真菌两类。 致病性真菌主要有荚膜组织胞浆菌（Histoplasma）、球孢子菌(Coccidioides)、副球孢子菌(Paracoccidioides)和芽生菌(Blastomyces)。此类真菌在正常人体内不存在，一旦侵入机体即可致病。在临床上比较少见，一般呈地方性流行。,2018/10/15,47,深部感染真菌检验,条件致病性真菌主要有念珠菌属（Candida）、 隐球菌(Cryptococcus)、 曲霉(Aspergillus)、 毛霉(Mucor)、卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii,PC)和 马内
20、菲青霉（Penicillium marneffei）等，此类真菌属于人体正常菌群，通常情况下不致病，只有在菌群失调、免疫力低下等一定条件下才会致病。是目前临床上深部真菌感染最常见的病原菌，且呈增长趋势。,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（一）分类和命名 属于出芽酵母科，目前已发现270余种，是一种条件致病菌。可引起人类感染的念珠菌属菌种有白念珠菌（C.albicans）、光滑念珠菌（C.glabrata）、季也蒙念珠菌（C.guilliermondi）、克柔念珠菌（C.krusei）、葡萄牙念珠菌（C.lusitaniae) 、近平滑念珠菌（C.parapsi
21、losis)、热带念珠菌（C.tropicalis) 。,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（二）临床意义 念珠菌属菌广泛存在于自然界，通常作为正常菌群存在于人体表和与外界相通的腔道中，当机体抵抗力低下或菌群失调时可导致感染。 近年来由于抗菌药物、激素和免疫抑制剂在临床上的大量使用，其引起的感染日益增多。 可侵犯人体许多部位如皮肤、黏膜、肠道、肺、肾、脑等，严重时可引起全身感染，,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（二）临床意义 常见白假丝酵母菌感染有： 皮肤假丝酵母菌病：好发于皮肤潮湿、皱褶处（腋窝、腹股沟、乳房下、肛门周围及甲
22、沟和指间）； 黏膜假丝酵母菌病：以鹅口疮、口角炎、外阴及阴道炎最多见； 内脏假丝酵母菌病：可由黏膜皮肤等处病菌播散引起，如肺炎、肠胃炎、肾孟肾炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等，偶尔也可发生败血症。,2018/10/15,51,（Candida）,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 1.标本的采集、运送和保存 采集分泌物、痰、粪、尿、血或脑脊液等标本。 2.常用检验方法 1)直接显微镜检查 取标本直接涂片、革兰染色，镜下可见革兰染色阳性、着色不均匀的圆形或卵圆形菌体以及芽生孢子和假菌丝，这是念珠菌感染诊断的重要依据。 2)分离培养 将标本接种在沙氏培养基
23、上，29或35培养l4d后，培养基表面可出现酵母样型菌落。 菌落特征与镜下形态,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 2.常用检验方法 2)分离培养 将标本接种在沙氏培养基上，29或35培养l4d后，培养基表面可出现酵母样型菌落。 菌落特征与镜下形态 (1) SDA(含氯霉素和庆大霉素)培养基： 25C30C培养12d开始生长，菌落为奶油色、隆起、柔软、光滑。有些菌在进行芽殖时，形成假菌丝。有些酵母菌还可形成具分隔的真菌丝。分离培养基无法辨别念珠菌属种间差异。,上海交通大学医学院,（Candida）,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海
24、交通大学医学院,（三）真菌检验 2.常用检验方法 2)分离培养 菌落特征与镜下形态 （2）科玛嘉念珠菌显色培养基(CHROMagar Candida) 经过37C 24h48h的培养，有4种念珠菌可以得到鉴定，翠绿色菌落为白念珠菌，铁蓝色菌落为热带念珠菌，淡粉红色菌落为克柔念珠菌，紫色菌落为光滑念珠菌。,上海交通大学医学院,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 3)厚壁孢子形成试验 在玉米吐温培养基2530C培养，48h内可形成厚壁孢子。4) 芽管形成试验 以人、动物血清作为培养材料，37C 培养23h白念珠菌可产生芽管，可以用来鉴别该菌。 5)生理
25、生化特征 不同菌种糖发酵和糖同化作用不同，这一特征可以用来区分不同念珠菌菌种。,上海交通大学医学院,（Candida）,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,糖（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、海藻糖）发酵指对某种糖发酵产生二氧化碳和乙醇，有气体产生的指示发酵，培养基的pH值可能不会改变； 糖(蜜二糖、纤维二糖、肌糖、木糖、棉籽糖、半乳糖醇)同化指在有氧环境中对作为唯一碳源的特定一种糖的碳水化合物的利用能力。,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 6)血清学试验 念珠菌属细胞壁(1-3)-D-葡聚糖含量高，G试验检测血
26、液标本中葡聚糖含量来判断有无念珠菌血症，不同念珠菌感染对葡聚糖检测无明显影响。 1，3-D葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，不存在于原核生物和人体细胞，是具有较高特异性的真菌抗原，因此，可将存在于血液及无菌体液中的BG视为侵袭性真菌感染（IFI）的标志。,深部感染真菌检验 念珠菌属（Candida）,上海交通大学医学院,马蹄鳖凝血系统中的凝血酶原G因子的亚基特异性识别BG后，可激活血清凝固酶原上的亚基，形成凝固酶，凝固酶参与凝血酶原级联反应，使凝固蛋白原转变为凝胶状的凝固蛋白，整个反应通过光谱仪测量其光密度可进行量化(BG水平可精确到1pg/mL) ,根据其引起的浊度变化对真菌-葡聚糖
27、浓度进行定量。,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),上海交通大学医学院,新生隐球菌广泛分布于自然界，是土壤、牛乳、水果等的腐生菌，也可存在于人体表、口腔和肠道中。在鸽粪中大量存在，通过吸入鸽粪污染的空气而感染，特别是一些免疫低下者易感。 （一）分类和命名 隐球菌属（Cryptococcus）最常见的致病菌为新生隐球菌和格特隐球菌，其中新生隐球菌有2个变种，即新生隐球菌grubii变种（C. neoformans var. grubii）和新生隐球菌新生变种（C. neoformans var. neoformans）。隐球菌属按血清学分类为A、B、C、D及A/D型。隐球菌的
28、有性型属于线状黑粉菌属(Filobasidiella)，,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),上海交通大学医学院,（二）临床意义 本菌属外源性感染，经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。新生隐球菌病好发于细胞免疫功能低下者，如 AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者。因此，临床上隐球菌性脑膜炎常在系统性红斑狼疮、白血病、淋巴瘤等病人中发生。近20年来，隐球菌的发病率不断升高。,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 1.标本采集 临床常见标
29、本为脑脊液、痰液、骨髓等。 2.直接显微镜检查 用病人脑脊液作墨汁负染色检查，可见透亮菌体，内有一个较大的反光颗粒和数个小的反光颗粒及出芽现象，菌体外有透明的宽厚荚膜。该方法是诊断隐球菌脑膜炎最简便、快速的方法。,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 3.分离培养 将标本接种在沙氏培养基，置25和37培养，病原性隐球菌均可生长，而非病原性隐球菌在37时不生长。培养25d后形成酵母型菌落。,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 4.鉴定 新生隐球菌的主要特征是：墨汁负染见到宽厚荚膜，37培
30、养生长良好，酵母型菌落，脲酶试验阳性，能同化葡萄糖和麦芽糖但不能发酵，同化肌酐（非致病菌不能）。 5.酚氧化酶试验 酚氧化酶是新生隐球菌区别于其它隐球菌的特有的酶，是含铜的末端氧化酶，能催化单酚羟基化为二酚，进一步将其氧化成醌，而醌在非酶促条件下自氧化生成黑色素。将新生隐球菌接种L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经25d培养，新生隐球菌形成棕黑色菌落。,2018/10/15,67,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),6.抗原检测 利用单克隆抗体，直接或通过乳胶凝集试验、ELISA等免疫学方法检测新生隐球菌荚膜多糖特异性抗原，已成为临床的常规诊断方法，其中以乳胶凝集试验最为常
31、用。,深部感染真菌检验 隐球菌属(Cryptococcus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 7.核酸检测 核酸检测为诊断隐球菌病提供了新的有效方法。临床标本可用痰液、支气管吸出物等，核酸检测方法有探针杂交法、PCR扩增法等。 8.动物试验 小鼠对新生隐球菌敏感，注入腹腔、脑或静脉内，小鼠在13周内死亡。而其他非致病性隐球菌不致病。,深部感染真菌检验 曲霉属(Aspergillus),上海交通大学医学院,广泛分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在于正常人体的皮肤和粘膜表面。 （一）分类和命名 其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、丛梗
32、孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉（A.terreus）和构巢曲霉(A.nidulans)，临床上以烟曲霉最为常见。,深部感染真菌检验 曲霉属(Aspergillus),上海交通大学医学院,（二）临床意义 曲霉是条件致病菌，在人体免疫功能降低时继发感染引起疾病，如长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素，放疗、化疗，各种恶性肿瘤、糖尿病、AIDS等可诱发曲霉病。 曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感
33、染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性支气管肺曲霉病。 有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌的发生密切有关。,深部感染真菌检验 曲霉属(Aspergillus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 1.标本采集 标本主要有痰液、脓液、分泌物、皮屑、耵聍、尿、粪便等。 2.直接显微镜检查 标本用氢氧化钾涂片，镜检可见分枝有隔菌丝，有时可见分生孢子梗、顶囊及小梗。若为有性期感染，可见到闭囊壳。,深部感染真菌检验 曲霉属(Aspergillus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 3.分离培养
34、 标本接种沙氏培养基，25或37培养，观察菌落特征，尤其是颜色的变化。 4.鉴定 曲霉的鉴定主要依据菌落质地、颜色，显微镜检查所见如分生孢子头形状；分生孢子梗：颜色、表面粗糙或光滑；顶囊：形态、梗占据顶囊表面积的大小；小梗：单层还是双层；分生孢子：表面是否光滑及有无纹饰；有无闭囊壳。 分生孢子头是曲霉属具有特征性的结构之一，由顶囊、产孢细胞和分生孢子链组成，可以是球形、放射形、圆柱形或棒形，且具有不同的颜色。,2018/10/15,73,生长迅速，菌落初黄、后为烟绿色或黑褐色，背面无色或黄褐色，绒毛状。顶囊烧瓶状；单层小梗，布满顶囊表面2/3；分生孢子近球形、表面粗糙；分生孢子头柱状；分生孢子
35、梗绿色、光滑。,烟曲霉菌落,烟曲霉,光镜 X400,2018/10/15,74,黄曲霉菌落,黄曲霉,光镜 X200,菌落初黄、后为黄绿色，背面无色或微褐色，有放射沟纹，棉絮状、有时粉末状。顶囊近球形；单层和/或双层小梗，布满顶囊表面；分生孢子近球形或梨形、表面粗糙；分生孢子头放射状或圆柱状。孢子梗无色、粗糙。,2018/10/15,75,生长迅速，菌落初白、后为黑色或黑褐色，背面无色或略带黑褐色，初为羊毛状、后呈粗绒状。顶囊近球形；双层小梗，布满顶囊表面；分生孢子球形、表面极度粗糙；分生孢子头放射状；孢子梗无色或淡黄色、光滑。,黑曲霉菌落,黑曲霉,光镜 X200,2018/10/15,76,生
36、长迅速，菌落肉桂色或褐色，背面黄到褐色，有放射沟纹，绒毛状。顶囊半球形；双层小梗，布满顶囊表面2/3；分生孢子近球形、光滑；分生孢子头紧密圆柱形；孢子梗无色、光滑。,土曲霉菌落,土曲霉，光镜 X200,2018/10/15,77,生长迅速，菌落初灰白、后为暗绿色，背面紫红至紫黑，中央粉末状、边缘绒毛状。顶囊半球形；双层小梗，布满顶囊表面1/2；分生孢子球形、粗糙有刺；分生孢子头柱形；孢子梗褐色、光滑；闭囊壳紫色。,构巢曲霉菌落,构巢曲霉,光镜 X400,2018/10/15,78,生长缓慢，菌落灰绿、浅黄或粉红色、逐渐变黑，背面无色或黄橙色，绒毛状。顶囊半椭圆或半球形；双层小梗，布满顶囊表面3
37、/4；分生孢子近球形、粗糙；分生孢子头疏松放射状。孢子梗无色或微黄、光滑。,杂色曲霉菌落,杂色曲霉,光镜 X400,返回,深部感染真菌检验 曲霉属(Aspergillus),上海交通大学医学院,（三）真菌检验 5.抗原检测 用竞争性ELISA测定病人血清中曲霉抗原，简单快速。 6.抗体检测 常用免疫扩散、对流免疫电泳、ELISA及间接免疫荧光法等检测病人血清中抗曲霉抗体。菌丝和培养滤液可作抗原。 7.皮肤试验 对过敏性支气管肺炎病人可用曲霉抗原提取液作皮试。,2018/10/15,80,检测曲霉GM抗原的ELISA试验 半乳糖甘露聚糖(galactomanna，GM)是曲霉细胞壁的成分，曲霉通
38、过生长菌丝释放到血液。半乳甘露聚糖由甘露聚糖和呋喃半乳糖组成，后者具有抗原性，被抗GM的单克隆抗体EB-A2 IgM识别。利用ELISA免疫方法检测侵袭性曲霉病患者体液中半乳甘露聚糖抗原成分以辅助诊断侵袭性曲霉病。,深部感染真菌检验 传统的接合菌门（Zygomycota）,上海交通大学医学院,传统的接合菌门（Zygomycota）因其在生物系统发生学中为复系群（polyphyletic group），现不再使用该门名称。 现阶段已将其置于球囊菌门（Glomeromycota）和四个亚门：毛霉亚门(Mucoromycotina)、虫霉亚门（ Entomophthoromycotina）、捕虫霉亚
39、门（Zoopagomycotina）和梳霉亚门（Kickxellomycotina）。,深部感染真菌检验 传统的接合菌门（Zygomycota）,上海交通大学医学院,毛霉亚门毛霉目中重要菌属有 根霉属（Rhizopus）、 黄梗霉属（Lichthemia 旧称犁头霉Absidia）、毛霉属（Mucor）、 根毛霉属（Rhizomucor）； 虫霉亚门虫霉目有 蛙粪霉属（Basidiobolus）和 耳霉属（Conidiobolus）,深部感染真菌检验-毛霉目,上海交通大学医学院,（二）临床意义 毛霉目真菌为条件致病菌，正常人体极少感染，但免疫功能低下者易感染。 依据临床表现分为： 鼻脑毛霉菌病
40、：系毛霉菌从鼻腔、付鼻窦沿小血管到达脑部，引成脑膜炎、脑血栓及脑坏死； 肺毛霉菌病：原发性为吸入毛霉菌孢子所致；继发性为吸入鼻脑毛霉菌病的分泌物所致。主要表现为肺特异性进行性支气管炎和肺炎，亦有肺梗塞及血栓形成,深部感染真菌检验-毛霉目,上海交通大学医学院,（二）临床意义 消化道毛霉菌病：病变可累及食管、胃、回肠、直肠等，表现为腹痛、腹泻、血便、呕咖啡样血等。 皮肤毛霉菌病：因外伤、手术或使用污染的包扎物引起的原发性感染，临床表现为丘疹、斑块、脓疱、溃疡、溃烂、坏死等。 由其他部位毛霉菌病播散引起的继发性感染，表现为结节、溃疡、坏死等。临床上常见的是鼻脑毛霉菌病。本菌感染发病急，病情进展快、病
41、死率极高。,深部感染真菌检验-毛霉目,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 1.标本采集 采集皮屑、脓液、血液、痰、尿、鼻窦抽取物、活体组织等标本。 2.直接显微镜检查 标本用氢氧化钾直接涂片检查，可见粗大无隔菌丝，偶见孢子囊及孢子囊梗。 3.分离培养 标本接种于沙氏培养基上，25或37培养，观察菌落。 4.鉴定 毛霉目真菌鉴定依据：菌落形态、色泽；有无假根和匍匐菌丝；分生孢子梗着生位置及分枝状态；孢子囊形态；有无囊轴、囊托及其形状；有无接合孢子及其特点。,2018/10/15,86,毛霉目能进行有性繁殖产生接合孢子和无性繁殖产生孢子囊孢子，菌丝较宽，常无分隔。有的菌丝在培养基表面横向生长，称为
42、匍匐菌丝（stolon），其产生的假根(rhizoid)伸入培养基内。孢子囊梗直接由菌丝长出，顶端形成孢子囊，内生孢子囊孢子。孢子囊内有球形或近球形的囊轴(columella)，囊轴基部与孢囊梗相连处成囊托(apophysis),2018/10/15,87,毛霉病KOH直接镜检,粗大无分隔菌丝,2018/10/15,88,接合菌孢子囊和孢囊孢子,毛霉目,上海交通大学医学院,2018/10/15,90,深部感染真菌检验-毛霉目真菌,根霉,梨头霉孢囊梗不与假根对应，,毛霉,有囊托,毛霉无匍匐菌丝及假 根,深部感染真菌检验 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,上海交通大学医学
43、院,在1956年从越南中华竹鼠的肝脏中首次发现，1959年正式命名。1973年在美国首次发现临床病例，普遍认为竹鼠是马尔尼菲青霉的天然宿主, 通过粪便排出该病原菌而污染环境，引起人的感染。东南亚和我国南部有马尔尼菲青霉病的流行区域。 （一）分类和命名 属于丛梗孢科，青霉属，双轮青霉亚属。马尔尼菲青霉是青霉属（Penicillium）中唯一的双相型真菌，自然界中以菌丝形式存在，在组织中则形成圆形或椭圆形细胞。有性阶段属于子囊菌门、真子囊菌纲、散囊菌目、发菌科、蓝状属。,深部感染真菌检验 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,上海交通大学医学院,（二）临床意义 侵入人体后，除
44、引起局灶型感染外主要引起广泛性、播散性感染。主要侵犯网状内皮系统，即肺、肝、肠淋巴组织、淋巴结、脾、骨髓、肾和扁桃体等，以肺及肝最为严重。临床表现为发热、畏寒、咳嗽、咳痰、消瘦乏力、肝和脾及浅淋巴结肿大、皮疹、坏死性丘疹、皮下结节或全身多发性脓肿等。 马尔尼菲青霉菌是条件致病菌, 免疫功能低下者易感染。马尔尼菲青霉病患者多继发于恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、糖尿病、结核等，尤其在AIDS 患者中有增多趋势,被认为是东南亚地区艾滋病患者最常见的机会性感染之一。,2018/10/15,93,临床所见,马尔尼菲青霉病,深部感染真菌检验 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,上海交通
45、大学医学院,（三）真菌检验 1.标本采集 采集痰、血液、脓汁、皮损、腹水、骨髓、溃疡分泌物等标本。 2.直接显微镜检查 皮损刮片、溃疡分泌物等标本涂片，PAS染色后镜检，可见到球形、近球形、椭圆形、有明显横隔的细胞，常形成桑葚状细胞团位于巨细胞内。有时可见到细胞外粗细均匀、两头钝圆的腊肠状细胞。,深部感染真菌检验 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 3.分离培养 血液、骨髓穿刺液、腹水、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等标本增菌后转种于2个沙氏培养基，皮损、痰直接接种于2个沙氏培养基，分别于25 和37 培养，每天观察菌落形态、产色素情况。,
46、马内菲青霉是一种双相菌，即在25时为菌丝相，在37时为酵母型。在沙氏培养基上25生长缓慢，34d 开始生长菌落初为灰白色膜状或淡黄色绒毛样，,深部感染真菌检验 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 4.鉴定 本菌鉴定主要依据双相真菌；直接镜检及病理检查找到典型的腊肠形、分隔的孢子；菌落特征；镜下帚枝状结构。,2周后菌落呈棕红色蜡样、有皱褶，并有白色绒毛样菌丝。产生的红色色素将整个培养基染成玫瑰红色。,深部感染真菌检验 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）,上海交通大学医学院,（三）真菌检验 5.动物试验 将菌悬液接
47、种小白鼠腹腔，1个月左右，小鼠肝、脾、肾、淋巴结发生病变，病变组织细胞内外可找到圆形、腊肠形、分隔的孢子，培养有马尔尼菲青霉生长。 6.抗原检测 用荧光标记特异性抗体，通过ELISA定量检测患者尿中马尔尼菲青霉抗原，由于操作简单、快速，常作为该病流行地区的常规诊断方法。 标本直接涂片检查时，注意与荚膜组织胞浆菌鉴别，虽然二者都是单细胞，但马尔尼菲青霉孢子从不出芽，常有横隔。,深部感染真菌检验 肺孢子菌（Pneumocystis）,上海交通大学医学院,由于肺孢子菌具有包囊、滋养体两种形态，且抗原虫药物对肺孢子菌有效，过去一直将其归为原虫，称为肺孢子虫。 但近年来分子生物学研究发现：包囊壁结构与真
48、菌相似；肺孢子菌线粒体的16S和5S核糖体RNA的核苷酸序列与真菌有更多的同源性，肺孢子菌的二氢叶酸还原酶和胸腺嘧啶合成酶的结构与真菌相似。故将其归属于真菌。但由于抗真菌药物对肺孢子菌治疗无效，故有的学者提出将其归为类真菌。,深部感染真菌检验 肺孢子菌（Pneumocystis）,上海交通大学医学院,（一）分类和命名 属于肺孢子菌科（Pneumocystis）。该属有7个种,为耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii， Pj)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii, Pc)、沙鼠肺孢子菌(Pneumocystis gerbil)、鼠型肺孢子菌(Pneumoc
49、ystis murina)、奥氏肺孢子菌(Pneumocystis oryctolagi)、韦氏肺孢子菌(Pneumocystis wakefieldiae)和ZL2005b肺孢子菌(Pneumocystis sp. ZL2005b)。,深部感染真菌检验 肺孢子菌（Pneumocystis）,上海交通大学医学院,（一）分类和命名 目前认为耶氏肺孢子菌只感染人类，而其他种的肺孢子菌只感染动物而不感染人类。因此，原有的卡氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii, pneumonia)不再使用，但沿用肺孢子菌肺炎(PCP)的诊断，全称为耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia）。,深部感染真菌检验 肺孢子菌（Pneumocystis）,上海交通大学医学院,（二）临床意义 肺孢菌广泛分布于自然界，主要经空气传播，健康人多为隐性感染，不引起任何症状。疾病多见于两种人：一种是婴幼儿、早产儿和营养不良者，另一种是任何年龄的先天性免疫缺陷或者大量应用免疫抑制剂和长期接受放射治疗的患者，尤其是AIDS患者。可以引起肺孢菌性肺炎(PCP)，其典型病变为肺泡间质浆细胞浸润。肺孢菌病是AIDS最常见、最严重的机会感染性疾病，病死率高达70100。,
