1、第三章 蛋白质工程,主要内容,3-1 蛋白质工程的发展历史,蛋白质的历史起源蛋白质工程的产生蛋白质工程的意义,蛋白质概念的历史渊源,旧称：朊 1728年，Beccari洗出面筋 1838年，荷兰科学家格里特发现蛋白 1841年，Liebig发表文章 1883年，Kjedahl发明定氮，发现氨基酸 1902年，确定氨基酸结构，测定肽键性质 1927年，发现酶也是蛋白 ,蛋白质工程的产生及意义,1982年，Winter 提出定点诱变 1983年，Ulmer发表专论，标志意义： 蛋白对生命的重要所在 蛋白质工程的难点：结构和功能间的关系,3-2 蛋白质的生物合成,蛋白质的结构三个配体（RNA）合成过
2、程,蛋白质结构基础1,氨基酸肽键,氨基酸的通式,组成蛋白质的常见氨基酸有二十种 ，通式如下： R不同，组成的氨基酸就不同,肽键、肽和多肽,蛋白质结构基础2,一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 功能与结构密切相关,三种RNA,mRNA程序rRNA（核糖体）装配车间tRNA运载工具,mRNA,三种RNA的协同工作,mRNA程序 rRNA（核糖体）装配车间 tRNA运载工具,合成过程,DNAmRNA蛋白质mRNA的阅读53；肽链的合成N端C端从mRNA到肽链的秘密肽链之前和肽链之后（合成过程三阶段）,密码子表,蛋白合成过程示意,3-3 蛋白质工程的内容及过程,理论背景内容程序 与基因工程的关系,
3、理论背景,序列结构功能之间的内在联系,内容,理论上的研究：序列结构功能应用上的分类：小改（1-n个氨基酸）中改（肽端或结构域）大改（从头设计）,具体程序,从功能设计到功能实现的反馈。,3-4 蛋白质工程的具体应用,提高蛋白稳定性增加活性融合蛋白嵌合抗体和人缘化抗体,蛋白质结构模拟与设计，李荣秀，化学工业出版社，2011 蛋白质组学研究 概念、技术及应用，张丽华，科学出版社，2010 蛋白质研究技术，颜真，第四军医大学出版社 ，2007 合成一个蛋白质，熊卫民，山东教育出版社，2005 重组蛋白分离与分析，范代娣，化学工业出版社，2004,课外书籍资料,DNA生命的控制器 从DNA到蛋白质 国外
4、大牛制作RNA聚合酶 DNA复制转录和翻译 DNA复制 基因指导蛋白质合成,课外视频资料,本章重点,蛋白质工程确立的历史事件 蛋白质工程的概念 蛋白质合成的分子学基础及过程 蛋白质工程的研究内容,第四章 酶工程,酶工程（英语：Enzyme engineering）是指工业上有目的的设置一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在一定条件下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其它目的的一门应用技术。,酶工程的定义,酶工程（英语：Enzyme engineering）是指工业上有目的的设置一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在一定条件下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其它目的的一
5、门应用技术。,主要内容,4-1 酶工程的产生及发展历史,人类对酶的认识历程酶制剂的生产固定化酶分子修饰非蛋白酶类-未来,人类对酶的认识历程,1578年，Kunne首先提出酶的概念 1833年，Payen和Persoz获得淀粉酶 1894年，Fisher发现酶的专一性 1896年，Bucher兄弟提出发酵本质认识 1903年，Henri提出酶底物配合说 1913年，Michaelis-Menten方程 1927年，Summer证明酶也是蛋白质 ,酶制剂的生产,1894年，日本高峰让吉制备高峰淀粉酶 1908年，Rohm制得胰酶 1949年，细菌淀粉酶发酵 1960年，Jacob和Monod阐明酶
6、合成机制 ,固定化酶,1916年，Nelson和Griffin发现酶固定现象 1953年，Grubhofer和Schleith明确固定化 1978年，日本人实现细胞固定化 ,分子修饰,酶分子修饰是通过对蛋白酶主链的剪接和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，以改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的优良性状，扩大酶的应用已达到较高的经济效益。 注意区分分子修饰所用的手段,1、金属离子置换修饰：改变酶分子中所含的金属离子。常用离子：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。 2、大分子结合修饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细改变。常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙
7、二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。 3、酶侧链水解修饰(肽链有限水解修饰)：肽链经有限水解，使酶的空间结构发生某些精细改变。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。 4、酶分子的侧链基团修饰：采用一定的方法（化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变。侧链基团改变引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。基团有：羧基、氨基、巯基、咪唑基、酚羟基、胍基、色氨酸吲哚基。,酶分子修饰的手段,酶的未来,酶结构与功能关系 酶的多方面、高效利用 高稳定性酶的开发 非蛋白酶类的研究进展如肌红蛋白的改造。,4-2 酶学基础及酶工程定义,酶的一般知识酶的结构与催化机制酶工程的定义,酶的一般知识,化学组成和性质
8、 催化反应特点：高效选择（特异、专一）产物 （纯度高）条件,酶的结构和催化机制,锁和钥匙说 诱导契合说 酶结构：活性中心和底物结合区域,锁-钥匙,诱导契合,酶工程的定义,酶的生产和应用所应涉及的系列技术,酶工程（英语：Enzyme engineering）是指工业上有目的的设置一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在一定条件下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其它目的的一门应用技术。,4-3 生物酶工程,克隆酶（不改）突变酶、从头设计酶（小、中、大改）进化酶杂合酶,进化酶,非理性手段 突变：易错PCR 高效筛选系统,杂合酶,把来自不同酶分子的结构单元（单个功能基、二级结构、三级结构或
9、功能域）或酶分子进行组合或交换，可以产生具有所需性质的优化酶杂合体。由两种以上酶成分构成。 杂合酶的构建方法是DNA水平的基础操作和酶学检测方法的结合，其实质是突变（组装）和筛选。目的是获得比亲本功能具有更高效率的、或者衍生出新功能的子代重组体。,3-4 化学酶工程,天然酶的化学修饰（外、内）固定化酶人工模拟酶,固定化酶,注意：固定化细胞和固定化酶的区别与联系,固定化酶,人工模拟酶,酶结构理论（半模拟和全模拟）：酶的选择性酶的活性中心化学反应动力学理论反应的过渡态理论,分子印迹酶,人工模拟酶-抗体酶,1946年，鲍林(Pauling)用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为
10、它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态（底物激态），从而降低反应能级。1969年杰奈克斯(Jencks)在过渡态理论的基础上猜想：若抗体能结合反应的过渡态，理论上它则能够获得催化性质。 抗体+过渡态 1986年，制成,课外书籍资料,食品酶学，郑宝东，东南大学出版社，2006 酶工程制药，李荣秀，化学工业出版社，2004 酶学，陈石根，复旦大学出版社，2001 酶工程，徐凤彩，中国农业出版社，2001,星雷分子美食课程第八课蛋白质和酶：转谷酰胺酶 泛素-蛋白酶体系统（UPS）动画 酶（汉水丑生） 长寿的秘密：端粒、端粒酶 酶联免疫吸附实验（ELISA）,课外视频资料,第五章 细胞工程,主要内容,5
11、-1 细胞工程的产生及发展历史,人类对细胞的认识历程植物组织及细胞培养动物细胞体外培养和核移植现代细胞工程,人类对细胞的认识历程,1604年，Janssen制造第一台显微镜 1665年，Hooke改进显微镜，发现小室 1676年，Hoek又改，发现大量微生物 1838年，Schlwiden说植物由细胞构成 1839年，Schwan说都是细胞，细胞相近 1855年，Virchow说细胞来自细胞 ,植物组织和细胞培养,动物细胞体外培养和核移植,胚胎或幼龄组织胰蛋白酶分解弹性纤维 单个细胞加培养液 细胞悬浮液 10代细胞 50代细胞 无限传代,原代培养传代培养,细胞株 细胞系,现代细胞工程,细胞壁的
12、去除、核移植的尝试童第周 细胞融合 细胞融合中的明星：杂交瘤技术（Kohler） （1975发明，1984，1995二度诺贝尔奖 1997年，多利羊证明体细胞的遗传全能性 2010年，人工合成生命,5-2 细胞学基础及细胞工程定义,细胞的结构与运行机制细胞工程的定义,细胞（生命基本单元）的结构,生物膜系统：细胞膜及细胞器 遗传信息表达系统：细胞核、质粒、核糖体 细胞功能系统：细胞质及细胞器,细胞工程定义,宏观工程 微观工程,细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。有细胞培
13、养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。,5-3 细胞培养,植物细胞培养动物细胞培养,宏观工程,植物细胞培养,动物细胞培养,悬浮式 贴壁式 混合式,动物细胞培养,滚瓶机,5-4 微观细胞工程,细胞重组和拆合细胞融合干细胞工程胚胎工程人造细胞,细胞重组与拆合,1938，第一人：汉斯-施佩曼（蝾螈） 1961，中国，童第周 （1989年鲤鲫核鱼） 克隆动物,细胞融合 不同细胞融合在一起,三种常见方法：物理法、化学法、生物法与重组基因导入方法对比,细胞融合,杂交瘤技术与单克隆抗体,单克隆抗体技术,干细胞工程,
14、干细胞的定义 具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞。可分化成多种功能细胞。 根据干细胞所处的发育阶段分为： 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）和 成体干细胞（somatic stem cell）。 干细胞（Stem Cell）是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。 干细胞的分辨难题, 2013年的诺奖,iPS细胞 （一般指诱导性多能干细胞） 诱导多能干细胞induced pluripotent stem cells iPS：2006年日本京都大学Shinya Yamanaka 细胞上率先
15、报道。把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。,小保方 晴子（Haruko Obokata），日本理化学研究所发育与再生医学综合研究中心学术带头人。 1983年6月29日生。 弱酸性处理可产生STAP细胞,这场登上自然年度十大科学事件的学术闹剧,以主角小保方晴子(Obotaka Haruko)的辞职（2014年12月19日），和STAP细胞的重现失败告终。,STAP细胞（万能细胞）
16、 Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency cells,细胞工程，李志勇，科学出版社，2010 细胞工程实验，李志勇，高等教育出版社，2010 细胞与分子免疫学基础,刘玉芬,东北林业大学出版社,2009 植物细胞组织培养,刘庆昌,中国农业大学出版社,2010 细胞工程,庞俊兰,高等教育出版社,2007 干细胞 人类疾病治疗的新希望,潘兴华,云南科技出版社,2004 组织学与胚胎学,唐军民,北京大学医学出版社,2008,课外书籍资料,单克隆抗体的制备 揭开“人造生命”的面纱（TED公开课） 细胞培养技术 Gibco细胞培养技术视频 动物细胞培养
17、技术,课外视频资料,本章重点,细胞的生物学基础 细胞工程的定义及细胞工程著名历史事件 不同种细胞的特点（植物细胞、动物细胞、干细胞、胚胎细胞） 细胞培养的基本过程 细胞融合与单克隆抗体,第六章 发酵工程,主要内容,6-1 发酵工程概述,发酵工程的产生发酵的定义及基本过程发酵工程的产品类型,发酵工程的产生与发展,与生物工程发展的历程相依相随,发酵的定义,酵母产生CO2 厌氧条件下分解代谢有机物释放能量 利用微生物生命活动获得产品的过程现代：包括动、植物细胞的悬浮培养,发酵的基本过程,发酵产品的形式,初级、次级代谢产物 生物大分子（酶、多糖） 菌体 利用微生物发酵进行转化反应,6-2 工业微生物,
18、常见种类菌种选育与保藏,常见工业微生物种类,细菌 放线菌 酵母菌 霉菌,细菌的形态（单细胞）,球菌 杆菌 螺旋菌,细菌细胞结构模式图,放线菌（Actinomycetes）,多数腐生,少数寄生,中性或偏碱性土壤,放线菌对人类的主要贡献产抗生素,4000多种抗生素,链霉素 土霉素 金霉素 卡那霉素 井岗霉素,肺结核水稻纹枯病肠道感染角膜炎,次级代谢产物,初级代谢产物,抗生素，色素，蛋白抑制剂，免疫调节剂等,乙醇，有机酸，氨基酸等,真核微生物,真核微生物,真菌,显微藻类,原生动物,酵母菌,丝状真菌（霉菌）,担子菌,酵母菌,糖酵解 酒精CO2 面包等单细胞蛋白脱蜡菌体（核酸，维生素）基因工程宿主菌,直
19、径： 2-5 m,用途,湿润、较光滑，有一定的透明度，容易挑起，菌落质地均匀 大多呈乳白色，少数红色 菌落比起细菌显得较大而厚,酵母菌的 菌落特征,常见的酵母菌,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）啤酒，果酒，酒精发酵，面包 热带假丝酵母（Candida tropicalis)单细胞蛋白 异常汉逊氏酵母（Hansenula anomala)乙酸乙酯 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)基因工程菌,目前已知有1000多种酵母,霉菌菌丝,霉菌 与其它菌比较,与酵母菌比 细胞壁：含几丁质 菌丝体,与放线菌比 菌丝：基内菌丝气生菌丝分子孢子梗 菌丝：大多是多细胞，有
20、隔膜 细胞结构,四种典型的霉菌,根霉毛霉曲霉青霉,特征,菌种的选育,现代选育方式,6-3 发酵工艺,种子培养发酵过程形式发酵培养基优化发酵过程控制,发酵的基本过程,发酵过程形式,批式发酵补料发酵带放（半连续发酵）连续发酵多级连续发酵发酵-分离耦合 ,连续发酵,连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。,优点 可提高设备利用率和产量； 发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制； 易于分期控制。可以在不同的罐中控制不同的条件。缺点 对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高； 营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低； 杂菌
21、污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。,培养基优化,碳源、氮源、微量元素、诱导因子等,发酵过程控制,温度 pH 通气 搅拌,6-4 生物下游工程,预处理与固液分离初步纯化（提取）高度纯化（精制）成品化及废液处理,生物下游一般过程,6-5 生化反应器,生化反应器类型通用式发酵罐气升式发酵罐其他生物反应器形式,生化反应器类型,酶反应器：单相式、多相式发酵反应器器：液态、固态,通用式发酵罐,通气 搅拌：传质传热,气升式发酵罐,气升式发酵罐的优点是能耗低，液体中的煎切作用小，结构简单。在同样的能耗下，其氧传递能力比机械搅拌式通气发酵罐要高得多。,固态发酵罐,微生物与发酵基础教程，宋超先，天津大学出版
22、社，2007 发酵工艺，孙俊良，中国农业出版社，2008 生物反应工程原理，贾士儒，科学出版社，2008 微生物工程工艺原理，姚汝华，华南理工大学出版社1996 生化工程，伦世仪，中国轻工业出版社，1993 生化反应工程，山根恒夫，西北大学出版社，1992 发酵工艺学原理，（英）PF斯坦伯里，中国医药科技出版社，1992,课外书籍资料,传统白酒固态发酵 家庭啤酒酿造 轻院啤酒酿造视频 精工啤酒与手工酿造 家庭自酿葡萄酒,课外视频资料,本章重点,近代发酵工程确立的标志事件 发酵的基本过程及发酵产品形式 常见工业微生物 菌种选育基本过程及保藏技术 通用式发酵罐结构及具体用途 生物下游工程基本情况,
23、第7章 生物工程发展中的安全问题,8-1 基因工程技术的潜在威胁,生态环境及生物多样性人体健康,转基因技术的安全性 外源基因的导入，可能引起体内一系列未知的结构和功能的变化，且这些影响会遗传给下一代。 外源基因引入是否会影响重要调节基因，如原癌基因？ 是否会有难以消灭的新病原生物出现？ 是否会造成生态学灾难？ 摄食后是否会直接影响人类健康或人类后代的健康？,8-2 转基因的安全性讨论,转基因作物及食品类型转基因作物及食品的安全性评价转基因作物及食品的安全性争论,转基因作物,8-3 转基因作物与食品的安全管理,国际现状国内现状何去何从,8-4 生物武器,生物武器的历史生物武器的特点基因改造生物武
24、器的威胁及防范,生物武器的历史,BC1325年，赫梯人攻打腓尼基人，兔热病 BC430年，古希腊和斯巴达，鼠疫终结雅典 1346年，鞑靼人包围Kaffa城，黑死病 17世纪，英国攻打印第安，天花 1859年，法国攻打阿尔及利亚，霍乱 一战时期，德国首先研制和使用生物武器 二战时期，日本大规模研制，731,生物武器的历史,第一阶段为初始阶段，德国。仅限于少数几种，如炭疽杆菌、马鼻疽杆菌等，施放方式主要有特工人员人工投放，污染范围很小。 第二阶段自本世纪30年代开始至70年代末，德、日、英、美。战剂细菌种类增多，后期病毒战剂。施放方法媒介昆虫为主，后期应用气溶液。运载工具主要是飞机，污染面积显著增
25、大。,生物战剂主要类型,病毒类：天花、马脑炎、热病毒 细菌类：炭疽、霍乱、鼠疫 立克次氏体：斑疹伤寒、战壕热 衣原体：鸟疫衣原体 真菌类：球孢子菌、组织孔孢浆菌 毒素类：葡萄球肠毒素、肉毒素 ,生物武器特点,致病性强 污染面积大 感染途径多 成本低，使用方便 危害时间长 防不胜防 ,致死性及失能性生物战剂,布氏杆菌属引起母畜传染性流产，人可感染！。,伤害人员的生物战剂按其引起疾病的伤害程度可分为两类： （1）致死性生物战剂，可使人员患严重疾病，死亡率大于10%，如黄热疾病的病毒、鼠疫杆菌等；O-157病毒、埃博拉病毒 （2）失能性生物战剂，主要使人员暂时丧失战斗力，死亡率较低，如委瑞拉马脑炎病
26、毒、布氏杆菌（Brucella）等。,基因武器,基因武器（genetic weapon），也称遗传工程武器或DNA武器。它运用先进的遗传工程这一新技术，用类似工程设计的办法，按人们的需要通过基因重组，在一些致病细菌或病毒中接入能对抗普通疫苗或药物的基因，或者在一些本来不会致病的微生物体内接入致病基因而制造成生物武器，尤其合成生物学的发展，可实现人工设计与合成自然界并不存在的生物或病毒等。,第九章 生物工程发展中的伦理问题,9-1 克隆人的伦理禁忌,克隆羊引发的社会冲击克隆技术目前存在的问题克隆人对人类伦理的挑战国际目前对克隆人的态度,克隆羊引发的冲击波,克隆羊多莉是世界上第一只用已经分化的成熟
27、的体细胞(乳腺细胞)克隆出的羊。这项研究对胚胎学、发育遗传学、医学有重大意义，且有巨大经济潜力。克隆技术可以用于器官移植，造福人类；也可以通过这项技术改良物种，给畜牧业带来好处。克隆技术若与转基因技术相结合，可大批量“复制”含有可产生药物原料的转基因动物，从而使克隆技术更好地为人类服务。 1996年7月5日-2003年2月14日 基因母亲：一只芬兰多塞特白面绵羊 线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊 生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊, 子女：生育6名，存活5名,目前的克隆技术问题,成活率低早衰畸形率高,9-2 人类胚胎干细胞研究的伦理,胚胎，啥时候才算人？社会对人类胚胎干细胞研究的反应各国政府对此类研究的
28、政策,9-3 人类基因组研究的伦理,人类基因组研究引发的社会问题基因隐私基因歧视基因组研究中的知情权基因争夺与保护,HGPELSI,基因隐私基因歧视基因争夺基因专利,(ethical, legal, social, implication),基因歧视,2001年，美国BNSF铁路公司暗地检测员工“腕关节综合症”基因表达谱2009年，佛山公务员招考中，发现“地中海贫血症”基因，而拒招多例基因缺失而被保险公司拒保,基因靶向药物：反义寡核苷酸 Antisense oligonucleotide (ASODN),传统小分子化合物药物,反义核酸药物,致病基因,致病蛋白,前景诱人，但极其昂贵！ 临床试验中，人和大型哺乳动物的ASODN用量达5mg/kg；每个体重为50kg的个体，每次实验用量约为0.25克，成本价高达2万元以上。 实验必须包括数十个重复，而且必须连续给药数十天，临床实验的费用十分惊人。 国际：仅有少数巨型制药公司有能力进行大规模寡核苷酸药物研发，ISIS , Santaris, Hybridon 国内：仅有军事医学科学院王升启教授开展大规模寡核苷酸药物合成和临床研究,
