1、2010年版药典附录无菌检查和微生物 限度检查方法增修定内容,杜平华,起草的指导思想,一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，着力解决发展中的问题。 二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国药品标准总体水平，着力提升中国药典在国际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会作出贡献。,2010年版无菌检查法增修订内容,一、进一步确定了无菌检查法的定义：无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。二、进一步明确了无菌检查保障
2、1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，但采用的措施不得影响微生物的生长。2 、无菌检查要进行环境检测增加了日常检验还需进行环境检测。2、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。,三、培养基增修订内容,删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的使用范围(用于培养好氧菌、厌氧菌及用于培养真菌) 删去选择性培养基使用的表面活性剂种类对氨基苯甲酸、聚山梨酯-80等。理由 经验证试验选择适宜的中和剂、灭活剂和表面活性剂,培养基适用性检查增修订内容 3、培养基灵敏度试验 删除 菌悬液制备中黑曲霉菌悬液的制备 “（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）” 修改为
3、“用适宜的方法吸出孢子悬液”。 增加在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加入0.05v/v）聚山梨酯80。,四、试验稀释液、冲洗液增修订为 增加根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。试验中使用的中和剂、灭活剂和表面活性剂除证明其有效性外还应证明对污染的微生物无影响修改为无毒性。,五、方法验证试验增修订内容,试验菌株 删除铜绿假单胞菌增加大肠埃希菌及大肠埃希菌菌液的制备(同金黄色葡萄球菌)。 薄膜过滤法 供试品用量 将规定量供试品 按薄膜过滤法过滤 修改为取每种培养基规定接种的供试品总量。,六、供试品的无菌检查增修订内容,检验量 直接接种法除另有规定外，每份培养基接种的
4、供试品量按表2、表3规定删除采用直接接种法时的规定。 阴性对照 无菌试验中若使用表面活性剂等应证明其有效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。,薄膜过滤法增加了抗生素供试品滤膜选择的指导 应选择低吸附的滤器及滤膜。若需要冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且冲洗量不宜过大修改为总冲洗量不得超过1000ml 。 水溶液供试品含抑菌成分需用适量的冲洗液冲洗膜修改为所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验.,装有药物的注射器供试品取规定量，删去装上无菌针头.修改为排出注射器中的内容物至无菌容器中，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，或非水溶性制剂供试品项下方法操作。无菌气雾剂供试品供试液的制
5、备将供试品置冰室修改为置至少-20的冷冻室约1小时。, 直接接种法删除内酰胺类或磺氨类供试品。,表1 、表2 、表3增修订,表1 （第3列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量 表2 （表题）上市抽验样品（液体制剂）的最少检验数量修改为液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量修改为每支供试品接入每管培养基的最少样品量第三列最少检验数量（瓶或支）1 全量 0 修改为供试品最少检验数量（瓶或支） 0 注 每种培养基各接种支供试品修改为若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。,表3 （表题）将上市抽验样品（固体制剂）的最少
6、检验量修改为固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量” 第三列最少检验数量、1 全量 0 修改为供试品最少检验数量（瓶或支） 0 注 每种培养基接种支培养基修改为若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。,微生物限度检查增修定内容,修改内容,1、培养条件 控制菌培养温度3537修改为3035(细菌、控制菌培养温度相同)。修改理由 此温度适于所有中温菌生长，一些高温菌在该温度下也可以生长。,增修订内容,2、结果报告 特殊品种可以最小包装单位报告特殊品种包括药典规定微量包装药品的检验量可以酌减。还有一些贵重药品也应考虑检验量。,3、检验量增修订内容,中药膜剂检验
7、量50 cm2 修改为100cm2 。 沙门菌检验量修改为检验量为20 g或20ml并注明（其中10 g用于阳性对照）。,4、供试液的制备增修订内容,供试品检查时使用表面活性剂应证明其对微生物生长和存活无影响修改为无毒性。供试液的制备若需加温时，可采用其他经验证的方法，但应均匀加热，且温度不应超过45。,新增贴剂供试液制备,供试液的制备经验证方法制备成供试液在无菌环境进行。避免粘贴面粘合在一起。置于含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，制成供试液。充分振摇。 也可采用以其他适宜的方法制备成供试液。,具抑菌活性的供试品增修订内容,删除应消除供试液的抑菌活性修改为当供试品具有抑菌活性
8、时，应尽量选择操作简便、快速的方法，应避免损伤供试品中污染的微生物。在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法。,离心沉淀集菌法,两次离心修改为一次离心； 500转/分离心，不超过3分钟，取全部上清液用于检查。影响因素 供试品 污染菌特性适用范围 仅使用于微生物限度检查供试液的制备。尽量避免使用，不可使用快速离心。,细菌、霉菌及酵母菌计数增修订内容,新增 计数培养基的适用性检查菌种大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis
9、）CMCC（B） 63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003, 增加了菌悬液的制备及保存条件。菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，若保存在28可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，按规定条件培养计数，同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。增加了对照培养。,2.新增常见干扰物的中和剂和灭活方法参见 表1常见干扰物的中和剂或灭活方法,6、供试品检查增修订内容,平皿法 删去采用平皿法进行菌数
10、测定时，连续23个稀释级的供试液。修改为按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。,培养时间修改内容除另有规定外，细菌培养48小时改为3天，霉菌、酵母菌培养72小时改为 5天，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。,菌数报告规则增修订内容,若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 细菌、酵母菌和霉菌平均菌落数在30300 、30100之间的稀释级修改为选取菌落数小于300cfu和100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。,薄膜过滤法增修订内容,新增内容 采用其它直径的滤膜，冲洗量应相应的进行调整（如使用膜直径增大冲洗液量也应相应增加，可保
11、证冲洗液覆盖整个滤膜）。删去每片滤膜的总过滤量不宜过大，修改为总冲洗量不得超过1000ml。,7、控制菌检查增修订增加控制菌检查用培养基的适用性检查；检查项目包括促生长、抑制及指示能力检查参照表2,新增培养基适用性检查方法液体培养基促生长能力检查。固体培养基促生长能力检查。培养基抑制能力检查。液体培养基指示能力检查。固体培养基指示能力检查。试验结果与对照培养基比较,控制菌检查用培养基的适用性检查,控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查 控制菌检查 培养基 特性 试验菌株 大肠埃希菌 胆盐乳糖 促生长能力 大肠埃希菌抑制能力 金黄色葡萄球菌 MUG 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌曙红亚
12、甲蓝或麦康凯 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群 乳糖胆盐 促生长能力 大肠埃希菌抑制能力 金黄色葡萄球菌 乳糖发酵 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌曙红亚甲蓝或麦康凯 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌,沙门菌 营养肉汤 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、 志贺氏属琼脂培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂 培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌三糖铁琼脂 培养基 指示能力 乙型付伤寒沙门菌 铜绿假单 胆盐乳糖 促生长能力 铜绿假单胞菌 胞菌 抑制能力 金黄
13、色葡萄球菌溴化十六烷基三 促生长能力 铜绿假单胞菌甲铵琼脂 抑制能力 大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基 促生长能力+指示能力 铜绿假单胞菌 金黄色葡 亚碲酸盐肉汤 促生长能力 金黄色葡萄球菌 萄球菌 抑制能力 大肠埃希菌 卵黄氯化钠琼脂促生长能力+指示能力 金黄色葡萄球菌或甘露醇盐琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 梭菌 梭菌增菌培养基 促生长能力 生孢梭菌哥伦比亚琼脂 促生长能力 生孢梭菌 白色念 沙氏葡萄糖肉汤 促生长能力 白色念珠菌 珠菌 沙氏葡萄糖琼脂 促生长能力+指示能力 白色念珠菌念珠菌显色培养基 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 吐温80玉米琼脂 促生长能力+指示能力 白色念珠菌,控制菌检
14、查法增修订内容,疑似致病菌的确证 微生物控制菌检查中没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。选择已被认可的菌种鉴定方法。如伯杰氏细菌鉴定手。控制菌检查方法验证删去阴性菌对照组。,大肠菌群检查用胆盐乳糖培养基改为乳糖胆盐。改梭菌检查用庖肉培养基为梭菌增菌培养基。改梭菌培养时间7296小时为48小时。,增加了白色念珠菌检验方法,增菌培养 沙氏葡萄糖肉汤培养基。分离培养 划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。,鉴定试验,典型菌落沙氏葡萄糖琼脂培养基 菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。念珠菌显色培养基菌落呈绿色或翠绿色菌落生长。,确认试验 取1%
15、吐温80-玉米琼脂培养基培养物进行染色，镜检及芽管试验。结果判断非革兰阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管判未检出白色念珠菌。,新增微生物限度检查法指导原则,一、抑菌剂效力检查法指导原则 二、药品微生物检验替代方法验证指导原则 三、微生物限度检查法应用指导原则 四、药品微生物实验室规范指导原则,一、抑菌剂效力检查法指导原则,指导原则的目的是为测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力及生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定提供指导。为防止药品由于微生物污染而引起变质，对服用者造成不良反应，在药品生产过程中加入一定剂量的抑菌剂。抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为
16、非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。,使用范围及原则,使用范围 如果药物本身不具有充分的抗菌活性，应根据制剂特性添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖，对患者造成伤害。,使用原则,所有抑菌剂都具有一定的毒性，添加抑菌剂时应注意以下原则:抑菌剂的用量应为最低有效量。 具有抗菌活性的制剂应确认其抗菌效力。,应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。,抑菌剂抑菌效力的测定,供试品的分类分为四类，但对于一些抗酸性制剂和含活生物制剂应考虑会降
17、低有益菌的生物活性。见表1,表1 产品分类类别 药品1 类 注射剂、 其他非肠道制剂， 包括 乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂 3 类 口服非固体制剂（非抗酸制剂）4 类 非固体抗酸制剂,培养基,培养基的制备胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基 胰酪胨大豆肉汤培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基 培养基的适用性检查 同控制菌培养基的适用性检查,抑菌剂效力测定方法,菌种 菌液制备 菌种 同培养基适用性检查，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌。菌液制备 制成每1ml含菌数约为108cfu的菌悬液。供试品接种影响因素给予指导 容器的材质、形状、体积、封口方式及容
18、器的PH等分别给予了指导。,接种菌量 接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%1%。放置 2025，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。,存活菌数测定 采用经验证的方法进行试验，计算1ml(g)供试品各试验菌所得的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。,结果判断 结果符合表3要求，可判断该产品抑菌效力符合规定。,表3 抑菌剂抑菌效力判断标准1 类 供 试 品 细菌 7天菌数下降不少于1.0 lg，14天菌数下降不少于 3.0lg,14天到28天菌数不增加。真菌 与初始值比，7、14、28天菌数均不增加。2 类 供 试 品细菌 14天菌数下降不少于2.0 lg，14
19、天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。3 类 供 试 品细菌 14天菌数下降不少于1.0 lg，14天到28天菌数不增加。真菌 与初始值比，14、28天菌数均不增加。4 类 供 试 品细菌，真菌 与初始值比，14、28天菌数均不增加。注：1、表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。2、0时菌数(初试值) 供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数，为0时菌数。,二、药品微生物检验替代方法验证指导原则,目的是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。在控制药品微生物质量中，需要采用替代方法 时，应进行方法
20、的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。,微生物检验的类型及验证参数药品微生物检验方法主要分两种类型定性试验 定量试验生物试验的特殊性抽样误差 操作误差 稀释误差 培养误差计量误差 计数误差药品质量标准分析方法验证指导原则不完全 宜于微生物替代方法的验证。,表1、 不同微生物检验类型验证参数表参数 定性检验 定量检验 准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性 重现性 注： 表示需要验证的参数 表示不需要验证的参数逐项按替代方法验证的要求进行验证和评价以便操作者了解方法的关键操作点,替代方法验证的一般要求,适用性验证前，对替代方法有一个全面的了解；由替代方法的研发者提供，
21、或由方法使用者完成。验证应至少使用2 个批号的样品，每批样品应平行进行至少3 次独立实验。在开展各参数验证时，除规定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。,三、药品微生物限度检查法应用指导原则,目的 为更好的应用微生物限度检查法及限度标准的合理执行提供指导。用途 用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。,1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，应对其用量、有效性、无毒性进行确认，无毒性确
22、认，试验的菌株应包括产品中可能污染的微生物。,2.检验方法的选择,供试液制备应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。,3. 供试液制备,本指导原则对离心沉淀法使用范围、方法及对检验结果影响的因素进行了分析和指导4.验证试验存在的问题及处理方法自药典收载方法验证以来在实施过程中存在一些具体问题，对这些存在问题进行了指导； 进行验证试验时，因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败。,处理方法 应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验 。
23、若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求。处理方法 应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。,在以上情况下，生产单位或研制单位应进行全面的风险评估以保证检验方法的可靠性，从而保证产品质量。,. 控制菌的确证,没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。仅规定若供试品检出疑似致病菌，确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法。,微生物限度标准,该指导原则对标准执行中存在的问题进行了分析和指导；明确了微生物限度标准使用范围 标准执行必检项目原则性要求 （丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂），应对其被微生物污染的风险进行评估。,用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应
24、符合无菌检查法要求。用于创伤程度难以判断的局部给药制剂，若没有证据证明药品不存在安全性风险则应符合无菌检查法要求。眼用制剂应符合无菌检查法要求。,含动物类原药材粉的口服中药制剂要求不得检出沙门菌。其中的动物类原药材粉是指除蜂蜜、王浆、动物角、阿胶外的所有动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝类，海蜇、冬虫夏草、人工牛黄等。 制定合理、安全和严格的微生物限度标准,四、药品微生物实验室规范指导原则,目的该指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。药品微生物的检验的对象具特殊性；活的生物、 分布不均匀、重现性差 必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行试验。,药品微生物实验室规
25、范包括以下几个方面 人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等。 人员 从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景,检验人员和管理人员培训,进行岗前培训 检验人员技能培训 熟悉相关检测 方法、程序、检测目的和结果评价。,管理人员 其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符。不断接受系统的教育与职责范围相关的培训。客观评估检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。,培养基,培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。该指导原则对培养基的制备、储存、灭菌及质量控制
26、进行了指导。,菌 种,实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。,该指导原则对菌种的来源、菌种保藏、 菌种的传代和使用、菌种的管理进行了详细的说明和指导。,、菌种保藏的原则,标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株.冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。,、菌种的传代和使用,工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代防止过度的传代造成菌种变异,工作菌株不可代替标准菌株.任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次
27、。实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。,菌种的管理,严格的程序化管理实验室必须建立菌种保存和使用文件的程序管理制度,实验室的布局和运行,实验室布局设计的基本原则 具有检测所需的适宜、充分的设施条件。合理的布局与设计，具有独立的实验室、辅助区域各区域应有明确标识。建立控制程序和标准操作规程。,建立合理的控制程序和标准操作规范,对进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规程。 消毒剂的配制应按标准操作规程配制，对所用的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。,建立检样品传递、储存、处置和识别管理程序。 建立带菌培养物溢出的意外事件制定处理规程。 建立合理的取样控制程序和标准操作规范。,设
28、备实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。使用的消毒剂应无菌。建立相应的操作和维护和保养的标准操作规程。,文件,文件应当充分表明试验是在实验室里按可控的检查法进行的，一般包括以下方面：质量管理文件、程序文件、技术操作文件。,实验记录的保存,实验结果可靠性的依赖于试验严格按照标准操作规程进行，包括正确的试验操作、实验记录、(所有关键的实验细节)，以便确认数据的完整性。,结果的判断,由于微生物试验的特殊性，在实验结果分析时，应从各个可能的方面去考虑，不但要假设被污染，而且要考虑微生物在原料、辅料或试验环境中存活的可能性。此外，还应考虑微生物生长特性。,对实验结果应进行充分和全面的评价。 实验结果不符合药典各论要求或另外建立的质量标准，应进行原因调查。 异常结果分析时，应充分考虑实验室环境、抽样区的防护条件、样品在该检验条件下以往检验的情况，样品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情况。,如果依据分析调查结果发现试验有错误而判实验结果无效，那么这种情况必须记录。实验室也必须认可复试程序，如果需要，可按相关规定重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查。,谢谢,
