1、叶绿体色素的提取、理化性质的鉴定及叶绿素含量的测定,目的和意义,因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用。,绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。,叶绿素的化学结构,一、叶绿体色素的提取,叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95的酒精或用酒精、丙酮和水的混合液提取或80丙酮提取。,(一)原理,(二)器材与试剂,器材：分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（
2、1mL）、试管及试管架、酒精灯等。 试剂：95%乙醇、醋酸酮、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等。,(三)方法与步骤,称取0.1g左右的鲜叶，剪碎，放入研钵中。加少许碳酸钙和少量的石英砂(中和细胞中的酸，防止镁从叶绿素分子中移出)与1ml 95%乙醇。在研钵中快速研磨。再加95%乙醇洗涤残渣中的色素，过滤。在25ml的容量瓶里定容至25ml，滤液即为色素提取液。,二、叶绿体色素某些理化性质的观察,叶绿素是一种二羧酸酯,在弱酸作用下，叶绿素中镁可被H+取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。,(一）原 理,取上述叶绿体色素5ml，放入试管中，加5盐酸两滴摇匀，观察溶液颜色的变化。当溶
3、液变褐色后，投入醋酸铜粉末少许，微微加热，观察溶液颜色的变化。,（二）铜代叶绿素反应,三、叶绿素含量的测定(分光光度法),(一)原 理 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别为665nm和649nm，类胡萝卜素的最大吸收峰为470nm，据朗伯比尔定律，求出叶绿素a、b含量。,Ca = 13.95A665 - 6.88A649 Cb = 24.96A649 - 7.32A665,(二)方法与步骤,用移液管取叶绿素提取液注入比色杯中，以95%乙醇作为参比溶液。根据实验要求，选用相应的波长在分光光度计上测定光密度。,（三）结果与计算,样品中叶绿素含量(mg/g) =比色杯中叶绿素浓度稀释倍数定容体积/样品量(g鲜重),注意事项！,叶绿素提取液避光保存。 酒精灯用完后要及时用灯帽盖灭，以防着火！ 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710nm或750nm波长下测量光密度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时光密度值的5%，否则应重新过滤。 由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好用波长较准确的高级型分光光度计。,【思考题】 1叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？2为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？,
