1、56 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI科技进展文章编号 1672-8270(2011)05-0056-04 中图分类号 TH 773 文献标识码 AChemiluminescence immunoassay technique and its progress/ CHEN Hai-bin/ China Medical Equipment,2011,8(5): 56-59.Abstract Chemiluminescence immunoassay technique is a combination of chemiluminescence with high sensitivit
2、y and immunoassay with high selectivity. The technique is widely applied to medical diagnosis, drug analysis, health and quarantine, life sciences and environmental monitoring. This article provides a brief overview of the historical background, basic principles, common luminous object and the featu
3、res of the chemiluminescent immunoassay.Key words Chemiluminescence; ImmunoassayFirst-authors address Department of Laboratory Tests, Wuzhou Peoples Hospital, Wuzhou 543000, China.化学发光免疫分析技术及其进展摘要 化学发光免疫分析技术是将化学发光与免疫分析方法相结合，综合了化学发光的高灵敏度和免疫分析的高选择性，被广泛应用到医学诊断、药物分析、卫生检疫、生命科学和环境监测上。简要综述了化学发光免疫分析研究的历史背景、
4、基本原理、常见发光体系及其特点。关键词 化学发光；免疫分析陈海斌作者简介陈海斌,男，(1970- ),本科学历，主管技师。广西梧州市人民医院检验科，从事专业:骨髓细胞形态学和免疫学检验。1 历史背景很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons1等于1941年首次采用荧光素作为标记物，紫外光激发发光，借助荧光显微镜来测定可溶性肺炎球菌多糖抗原而获得成功。荧光免疫分析（fluoroimmunosassay FIA）技术是标记免疫技术中发展最早的一种。传统荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰,分析灵敏度较低；
5、同时由于FIA所需仪器较复杂，限制了它的应用。1959年,美国科学家Yalow和Bersono2创建了具有划时代的放射免疫分析技术(radioim-munoassay,RIA)，用于血清中胰岛素含量的测定。RIA的建立是检测方法的重大突破。其优点是：成本底、灵敏度高；周围环境和干扰物质对检测结果的影响较小；与同位素结合的抗原或抗体不影响基本的免疫反应；放射测量体系齐全。其缺点是：同位素的半衰期短，试剂盒不易储存；不易实现自动化；由于放射性同位素的使用带来了污物处理的难题，对环境和操作人员带来潜在的危害。1966年，Engrall3等人将抗原抗体特异性免疫反应和酶的高效催化作用相结合，用特定的酶
6、标记抗原或抗体，使之成为具有示踪活性的免疫酶，根据免疫酶催化底物的显色程度，对待测物进行定性或定量测定，建立了酶免疫分析法(Enzyme Immunoassay EIA)。该法克服了RIA中放射性污染的弊端，具有设备简单，操作安全等优点。这种依靠比色法或偏振光法的检测技术存在酶不稳定，光度测量范围窄，灵敏度不高，难以定量、易造成漏诊和假阳性等不足，受到了应用上的限制。1977年，Halmann4在RIA和EIA基本理论的基础上，以化学发光信号示踪，建立了化学发光免疫分(ChemiluminesentImmunoassay CLIA)技术。早期的CLIA具有和RIA相似的特异性, 但因光信号持续
7、时间太短，灵敏度低于RIA,达不到临床应用水平。广西梧州市人民医院检验科 广西 梧州 543000中国医学装备2011年5月第8卷第5期 China Medical Equipment 2011 May Vol.8 NO.5ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI 57科技进展90年代初首先由英国Amersham公司研究人员发现在HRP催化的Luminol发光反应中加微量对碘酚作为发光稳定剂，可以使发光信号持续2030 min。随后生产出试剂盒，标示了化学发光技术进入了临床应用的开端。1990年Leland5等人建立了电化学发光反应系统之后,以电子得失过程中的电位差作能量激发2 基本原理化
8、学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析2个系统6。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化学发光物质经氧化剂的氧化后,形成一个处于激发态的中间体,会发射光子释放能量以回到稳定基态,发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测，根据化学发光标记物与发光强度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的含量7。3 常见的发光体系3.1 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）及其衍生物是最早在CLIA中使用的一种常用的化学发光物质
9、8-10这类物质的发光为氧化反应发光，它们在碱性条件下通过辣根过氧化物酶（HRP）催化，被H2O2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体,当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射光波长为425 nm。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但由于标记后发光强度降低而使其灵敏度受到影响，近年来改用HRP标记抗原或抗体，免疫反应后，利用鲁米诺作发光底物，在发光启动试剂(NaOH+H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于免疫反应中酶的浓度。如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。目前通常采用的体系是luminol/H2O2/HRP/Enhance System
10、，如图4所示，即用HRP标记抗原或抗体，以源的电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay ECLIA)，与CLIA相比:灵敏度更高，线性范围在6个数量级，下限达1 pmol；检测速度更快，仅需几分钟到十几分钟。不同标记物免疫检测技术的灵敏度、线性范围和试剂有限期的比较如图1-3：图1 几种标记/检测技术灵敏度的比较图4 鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统图5 吖啶脂化学发光系统图2 几种标记/检测技术线性范围的比较 图3 几种标记/检测试剂的有效期比较鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂，用NaOH+H2O2作发光
11、启动试剂，化学发光反应2 min后，光发射强度达到最高峰。使用增强剂后发光的持续时间可延长至3060 min,发光强度至少增加1000倍以上，并且“本底”发光显著降低。3.2 吖啶类化合物光泽精是第一个被发现有化学发光性质的吖啶类化合物,Klee等11研究合成了更稳定的吖啶酯衍生中国医学装备2011年5月第8卷第5期 化学发光免疫分析技术及其进展-陈海斌58 ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI科技进展物，它们应用于CLIA通常采用的体系是Acridimium ester/H2O2系统，如图示5。即用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体或抗原，用HNO3+H2O2+NaOH做发光启动试剂，发光机
12、理是：在碱性H2O2溶液中，当其受到过氧化氢离子进攻时，生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大发射波长为 430 nm的光子。吖啶类化合物的发光效率高，量子产率可达0.05，作为标记物用于免疫分析，其发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，也不需要增强剂，从而降低了背景发光，提高了信噪比，干扰作用少。3.3 （金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物该发光体系是目前最重要、最灵敏的一类发光体系,其主要代表是Bronstein等12提出的ALP-AMPPD发光体系。AMPPD是一种超敏感的AP底物,它首先在AP的特异催化下迅速脱磷
13、酸基生成AMPD-阴离子中间体(半衰期230 min), 此不稳定的中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金钢烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出发出 max为477 nm的光，并可持续几十分钟，其发光机理如图6所示。该体系中溶液的pH增高会增强发光强度,实验证明最佳pH为9.0,在该体系中加入水溶性的大分子物质牛血清白蛋白(BSA)或十四烷酰氨基荧光素与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)构成的水溶性胶粒,可使发光强度增强400倍。该化学发光体系有发光持续而稳定的特点。应用于CLIA通常采用的体系是Dcridinium ester/AP/Enhance System, 即
14、用碱性磷酸酶(AP)标记抗原或抗体，用（金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物做发光底物，在发光底物中加入增强剂。对AMPPD加以改进的CSPD、CDP-Sta具有更好反应动力学，它们的稳定性、信噪比和灵敏度有更一步提高，是新一代化学发光物质。图6 AMPPD及衍生物的化学发光系统图7 电化学发光过程3.4 电化学发光体电化学发光免疫分析(Electrochemi-luminescence,ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程。图示7。ECL的反应在电极表面进行,发光底物为三联吡啶钌Ru(byp)23+,三丙胺(TPA)用来激发光反应。在阳极表面,两种物质同时失去电子。在电极板上Ru(by
15、p)23+被氧化成Ru(byp)33+,TPA也被氧化成阳离子自由基(TPA+*),TPA+*自发地释放一个质子而变成非稳定分子(TPA*),将一个电子递Ru(byp)33+,形成激发态的Ru(byp)23+*。Ru(byp)23+*在衰减的同时发射一个波长为620 nm的光子,重新回到基态Ru(byp)23+。这一过程在电极表面反复进行, 发光过程中的标记物基本不被消耗，产生高效、稳定的连续发光,并不断增强13。ECL的突出优点是:标记分子小,可实现多标记,标记物非常稳定;发光时间长,灵敏度高，最小检出值可达1 pmol以下；光信号线性好,动力学范围宽,超过6个数量级;可重复测量,重现性好;
16、可实现多元检测和均相免疫分析;快速,完成一个样品的分析通常只需18 min;可实现全自动化15。其缺点是：反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。目前商品化的ECL分析系统只有Roche公司的ECL全自动分析系统。3.5 生物发光体系北美荧火虫体内的荧光素/荧光素酶是著名的生物化学发光体系,它由虫荧光素酶、虫荧光素D-(-)-2-6-羧基-2苯并噻唑-2-噻唑啉-4-羧酸、ATP、Mg2+及O2所组成。虫荧光素酶在催化时,首先与虫荧光素酰腺苷酸(由Mg
17、2+-ATP与虫荧光素复合而成)生成复合物,然后该复合物放出质子,酶变构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。另一生物发光体系是水中国医学装备2011年5月第8卷第5期 化学发光免疫分析技术及其进展-陈海斌ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI 59科技进展Coons AHand Kaplan MHI.Ocalization of antigens intssue cellsImprovements in a method for the detectionof antigen by iTleans of fluorescentantlbodyJJ Exper Med, 1950,91:1-1
18、3Bersono S A and Yalow R SQuantitative aspects of the reaction between insulin and insulin-binding antibodyJJ Clin Invest, 1959,38:1996-2016Engrall EPerlmannPEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulinGJImmunochemistry, 1971,8:871-874Halmann M,Velan B,Sery T.Rapid
19、identification and quantitation of small numbers of microorganisms by a chemiluminescent immunoreaction. Appl Environ Microbiol,1977,34(5):473-477.Leland J K,Powell M J.Electrogenerated 参考文献 Chemoluminescence:anoxidative reduction type ECL reaction sequence using tripropyl amineJ. J Electrochem Soc,
20、1990,137(10)3127.李美佳.当代免疫学技术与应用M.北京:北京医科大学国协和医科大学联合出版社,1998,549-561.韩佩珍.化学发光免疫分析J.国外医学放射医学核医学分册, 2000,24(5):196-200.Rilo I,Takashi H.Direct determination of plasma endothelin-1 by chemiluminescence enzyme immunoassayJ.Clin chem, 1996,42(8):1155-1158.Helen L,Larry J K.Influence of different Luminols
21、on the characteristics of the chemiluminescence reaction in human neutrophilsJ.J Biolumin Chemilumin,1995,10:353-359.Metelitxa DI,Eryomin AN.Enhanced chemiluminescence in the oxidation of luminal and an isoluminol cortisol conjugate by hydrogen peroxide in reversed micellesJ.J Biolumin Chemilumin,19
22、92,7:21-26. Klee GG,Preissner CM, Schryver PG,et al.Multesite immunochemi-luminometricassay for simultaneously measuring whole molecule and amino-terminalfragments of human parathyrin.Clin Chem,1992,38(5):628-635.Bronstein I,McGrath P. Chemilu-minescence lights up.Nature, 1989,338(6216):599-600.Rich
23、ter MM. Electrochemi-luminescence(ECL).Chem Rev, 2004,104(6):3003-3036.陈扬,陆祖宏.发光标记分析及其在核酸检测中的作用J.化学通报, 2001(9):537-547.孙秀新,闫国婷,杨宇龙.化学发光新体系在药物分析中的应用研究进展J.河北工业科技,2008,25(4):256-258.高荣,赵一泽.化学发光免疫分析技术应用研究进展J.中国生物制品学杂志, 2008,21(4):338-342.母发光蛋白,它不需要加入荧光素酶,只需加入Ca2+或Se2+便能通过分子内反应而发出 max为470 nm的蓝光。生物发光体系的特点
24、是发光效率、灵敏度、选择性均非常高13。3.6 其他无机氧化剂的化学发光体系孙秀新14等就近几年来一些无机氧化剂直接氧化一些物质产生化学发光的化学发光新体系,如高锰酸钾、铈()、过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸盐和铁氰化钾等在药物分析方面的应用和研究进行过综述。4 小结化学发光免疫分析是根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏度的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，借以检测微量抗原或抗体的一种新型非放射标记免疫分析技术。CLIA具有灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器能实现自动化等优点。CLIA应用范围较广,既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体,又可用于核酸探针的检测。CLIA与放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(FIA)及酶免疫分析(EIA)相比,具有标记物制备容易、不污染环境、稳定性高、并可实现全自动化等优点，提供了一种痕量或超痕量的非放射性免疫检测手段。是目前已有的各种免疫分析中最完善的分析方法，是免疫分析重要的发展方向。1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 收稿日期：2010-02-12中国医学装备2011年5月第8卷第5期 化学发光免疫分析技术及其进展-陈海斌
