1、在4月15日考试之前 自学内容： 第二章 细胞 根据P101学习提要 第二篇 植物生物学 根据P208 学习提要 第三篇 动物生物学 考试之前把习题集上的十套试卷做完。,15过夜的韭菜不能吃，是因为会产生大量的亚硝酸盐。亚硝酸盐危害健康是因为它在体内（ ） A导致酶和蛋白质的变性 B导致DNA的损伤，诱发细胞癌变 C破坏细胞膜的结构 D阻断呼吸链上的电子传递,2009年初赛 P习题集15,基因工程（重组DNA技术）,一、概念,（高中课本）将从一个生物体内分离得到的或人工合成的目的基因导入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物的技术。,基因工程又叫遗传工程、重组DNA技术、分子
2、克隆或基因克隆。,第一节、基因工程的概念和内容,供体细胞,（1）目的基因的分离、获取和制备,二、基本流程 P奥赛经典549,限制性内切酶,（2）目的基因和载体连接成重组DNA分子,重组质粒,第二节 基因工程的工具酶,一、限制性内切酶（限制酶）,概念能识别DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶。在DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键。其识别序列往往呈回文结构。,2. 命名（自己看）,（补充）修饰酶,修饰酶：修饰宿主自身的DNA，使之打上标记。如果两条链均已甲基化，则不发生反应。对于半甲基化的DNA，可使未甲基化的链甲基化。如果识别位点上两条链均未甲基化，则该DNA将被限制
3、酶切割。,3. 限制酶的分类,类：序列外随机切割，基因工程中不用。,类：序列内特异切割，回文结构，基因工程中常用。,：序列外特异切割，非回文结构。基因工程中特殊时候使用。,T,T,C,G,A,A,A,A,G,C,T,T,5,3,3,5,C,C,T,A,G,G,G,G,A,T,C,C,5,3,3,5,Hind ,BamH ,4. 类限制酶的特点,（1）每一种酶都有各自特异的识别序列识别序列通常为4、5或6个碱基对（bp）base pair = bp,（2）识别序列为回文结构,T,T,C,G,A,A,A,A,G,C,T,T,5,3,3,5,Hind ,（3）在识别序列内（大多数酶）或两侧切割,Hi
4、nd ,少数酶的切割位点在识别序列的两侧,EcoR ： 5 CCAGG 3,末端类型,平头末端,黏性末端,5突出末端（更常见）,3突出末端,Sma ,Pst ,Hind ,3突出末端,5突出末端,5. 同裂酶和同尾酶,同裂酶：识别序列和切割位点均相同的酶。,同尾酶：识别序列不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。,BamH ,Bgl ,2009年江苏省初赛 P习题集38 80能够识别DNA特殊序列的核酸水解酶是： ADNA酶 B限制性内切酶 C核酸外切酶 D磷酸二酯酶,答案：B,14下图为四种限制酶BamH 、EcoR 、Hind 和Bgl 的识别序列：,切割出来的DNA黏性末端可以互补配对
5、及正确的末端互补序列是 （ ）ABamH 和EcoR ；末端互补序列一AATT一BBamH 和Hind ：末端互补序列一GATC一 CBamH 和Bgl ：末端互补序列一GATCDEcoR 和Hind ；末端互补序列一AATT一,2008年初赛第14题 P习题集49,2010年初赛第58题 P习题集13 58限制性内切酶Sal识别的序列是GTCGAC，酶切后在5-侧产生4个碱基突出，限制性内切酶Xho识别的序利是CTCGAG，酶切后也在5-侧产生4个碱基突出。如果将Sal酶切过的插入片段与Xho酶切过的质粒载体混合，再进行连接反应，那么产生的连接产物所具有的性质是： A使用Sal或Xho 处理
6、，插入物都会释放出来 BSal处理可以使插入物释放出来，但Xho 不行 CXho处理可以使插入物释放出来，但Sal不行 D无论使用Sal或Xho 处理，插入物都不会释放出来,既能连接黏性末端，也能连接平头末端。,二、DNA连接酶,在3-OH和5-磷酸基团之间形成磷酸二酯键。,三、DNA聚合酶 （P554）,四、其他的酶,第三节 基因工程的载体 P555,载体：运载外源DNA分子有效地进入受体细胞的工具。,载体必需满足的条件： 有多种限制酶的切点，每种酶最好只有一个切点； 能在受体细胞中自我复制； 有便于选择的标记基因（如四环素抗性基因）； 具有促进外源DNA表达的调控区（如强启动子）； 使用安
7、全。,一、质粒载体,质粒是多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，能自主复制。含有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长有利。,二、噬菌体载体,三、柯斯质粒载体（含有噬菌体cos位点的质粒）,四、人工微小染色体（可将大片段的外源基因导入真核细胞）例如：酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）哺乳动物人工染色体（MAC）,五、表达载体（可使目的基因在宿主细胞中大量表达的载体）包括：原核表达载体；真核表达载体。,六、穿梭载体（补充）含有在两种宿主细胞中复制的起点（ori），可在两种细胞中复制和存在的载体。如：既能在原核细胞中复制，又能在真核细胞中复制的载体。,2009
8、年江苏省初赛 P习题集29 31（单选）一个酵母的穿梭载体具有的最显著特征是它含有：A细菌和酵母的选择性标记 B着丝点序列以方便复制后的分配C细菌和酵母的复制起始区D端粒序列以便大的DNA插入物能够在酵母细胞中得以维持,（答案：C）,讲到此处,28某些噬菌体基因组DNA上的碱基发生糖基化和甲基化修饰，这种修饰的主要功能是（ ） A促进基因组DNA整合到宿主基因组上 B保护病毒DNA受到限制性内切酶的水解 C有利于核酸正确地排列 D稳定DNA，防止突变,2009年江苏初赛 P习题集28,PCR（聚合酶链式反应）,PCR（polymerase chain reaction）：在体外快速扩增DNA的
9、技术。,只需数小时，便可将极微量的DNA片段扩增数十万乃至数亿份拷贝。,0.2 mL PCR管,PCR仪,基本原理：变性（94，1 min，DNA两条链解开）退火（55左右，1 min，引物与模板链结合）延伸（72，1 min，在引物的引导下合成子链） （以上过程循环30次左右）,T,A,A,C,C,G,T,A,G,3,A,C,C,C,A,T,T,G,G,C,A,T,C,T,G,G,5,5,3,编码链,G,上游引物（正向引物）,下游引物（反向引物）,模板链,模板链,正向引物与编码链5-端序列相同,反向引物与模板链5-端序列相同,通常反应开始时先在94加热510 min，使DNA完全变性。然后进
10、入热循环。经过约30次循环后，最后一次延伸时间延长到10 min，使没有延伸完全的产物尽可能延伸完全。,基本原理：变性（94，30 sec，DNA两条链解开）退火（55左右，45 sec，引物与模板链结合）延伸（72，1 min，在引物的引导下合成子链） （以上过程循环30次左右）,只要有聚合酶和足够的4种dNTP，PCR反应的全过程就可以不断重复，其扩增的拷贝数，理论上的最高值应是2n。可从一根毛发的毛囊、血迹等样品中扩增DNA。这对于法医学有特殊的应用价值。正因为PCR技术有如此高的扩增能力，所以DNA样品和实验试剂均应严格避免被污染。,引物设计的原则：引物长度：2024 nt引物中G+C
11、含量为40%60%引物与靶序列间的Tm值高于55引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率70%两条引物间避免有互补序列（否则易形成引物二聚体）避免引物自身配对形成发卡结构。,PCR反应体系,0.2 mL PCR管,PCR使用的DNA聚合酶是热稳定的。有的酶无校对功能，有的酶有校对功能（叫高保真酶）。,Mg2+用于激活DNA聚合酶，起到激活剂作用,琼脂糖凝胶电泳,阴性,DNA 泳动方向,若阴性对照也出现条带，说明试剂被污染了。,maker,DNA电泳图片,2010初赛第70题 P习题集16 PCR的灵敏度非常高，因此经常需要做阴性对照，以测定实验中是否发生了污染。你认为在设计PCR反应的阴性对照实
12、验的时候，反应混合物中不应该加： A模板 B引物 CDNA聚合酶 D镁离子,2010初赛第71题 P习题集16 PCR的最后一步反应通常是： A专门的变性，以灭活反应系统中所有的酶 B专门的退火反应，以耗尽所有的引物 C专门的延伸反应，使没有延伸完全的产物尽可能延伸完全 D加入EDTA，终止反应,2009年江苏省初赛 P习题集29 如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1，需要的一对引物序列是： 5CTTCGAAATTC基因1TCTCCCGATCGG基因2AAGATCAAATCCTTTGCTCT3 A正向引物是TTCGAAATTC，反向引物是GATCGGGAGA B正向引物是CCTTTGCT
13、CT，逆向引物是TCCCGATCGG C正向引物是GAATTTCGAA，逆向引物是TCTCCCGATC D正向引物是GATCGGGAGA，逆向引物是TTCGAAATTC,2011年江苏省高考第33题（最后一题）,（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。,从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。,（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。,答案：
14、引物和引物局部发生碱基互补配对而失效 引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效,（3）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。,DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。,（4）用限制酶EcoR 、Mbo I单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoR 、Mbo I的切割位点。,核酸分子杂交 P573基本原理：在一定条件下，单链DNA或者单链RNA能与另一条具有同源序列的单链DNA互补配对，从而形成杂交分子。,杂交分子的类型：,DNA
15、 / DNA,RNA / RNA,DNA / RNA,利用探针来检测目的基因 探针的特点： 必须为单链DNA或单链RNA 必须是均一的，其序列是已知的 带有标记（放射性同位素或荧光）,例子：,核酸的分子杂交分为两种类型：,Southern 印迹,Northern 印迹,1. Southern 印迹,这项技术用于检测特定的DNA序列，用于分析基因的结构。Southern印记是以发明者牛津大学的E. M. Southern 命名的。,限制酶消化DNA,酶切片段电泳分离,通过毛细管作用将凝胶中的DNA酶解片段 转移到膜上,加入放射性标记的探针进行杂交,洗膜，去除未杂交上的探针,曝光，看X光片上有无杂
16、交带,2. Northern 印迹,这项技术用于分析RNA。,提取纯化细胞中的RNA-电泳、分离-转膜-与探针杂交-洗膜-曝光-X光片上显示出杂交带,低水平表达的基因的mRNA只出现较弱的杂交带； 高效表达的基因的mRNA会出现颜色较深的杂交带。,Northern 印迹可以分析某个基因是否表达及表达量的多少。,RNA电泳图片,蛋白质印记（Western blot）,Western blot是一种免疫学检测方法。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,转移到膜上,加入某种蛋白的一抗,加入（同位素或荧光标记的）二抗,X光片曝光，显示条带,一抗指抗体，二抗指抗体的抗体,根据条带的有无可判断某个基因是
17、否表达；根据条带的灰度可判断表达量的多少。,基因芯片技术,P奥斯经典587-588 高通量、大规模研究基因的表达谱。,基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列等。是指将cDNA、RNA或寡核苷酸以点的形式结合在尼龙膜、玻片或塑料片上，形成矩阵排列，与同位素或荧光标记的探针进行核酸分子杂交，通过放射自显仪或荧光扫描仪检测杂交信号。,cDNA指以mRNA为模版复制的DNA,正常组织RNA,肿瘤组织RNA,正常组织CDNA,反转录,绿色荧光标记,肿瘤组织CDNA,红色荧光标记,反转录,混合，与芯片杂交,洗涤，荧光信号扫描仪检测,若都有，则为黄色，即绿色+红色=黄色,2009年初赛 30以下可用来确定人某种细胞所有的基因的表达水平的技术手段是（ ） ASouthem印迹 BNorthern印迹 CWestern印迹 D基因芯片,2007初赛 77Western印迹技术用于检测（ ）ADNA BRNA C蛋白质 D多糖,（答案：D）,（答案：C）,57在使用DNA芯片分析小鼠肝细胞和脾细胞基因表达状况的时候，制备肝细胞cDNA用绿色荧光标记，制备脾细胞cDNA用红色荧光标记。如果将等量的肝细胞cDNA和脾细胞cDNA混合以后与芯片杂交，那么，芯片上显示在肝细胞和脾细胞都表达的基因的斑点颜色应该是： A红色 B绿色 C黄色 D黑色,2010年江苏初赛 P习题集57,
