1、XX 肿瘤相关功能基因 XXX 研究课题设计一、XX 肿瘤相关基因功能研究整体技术路线不同肿瘤细胞株X X X 表达检测X X X s h R N A l e n t i v i r u s细胞功能实验增殖 ( M T T )细胞周期与凋亡 ( 流式P I & A n n e x i n V 双染 )克隆形成侵袭转移( t r a n s w e l l 实验 )裸鼠成瘤实验肿瘤细胞沉默X X X 后成瘤肿瘤细胞成瘤后定点注射瘤体2 株高表达 X X X 基因肿瘤细胞平行实验作用机理研究r e a l - t i m e P C R 检测下游分子表达变化W e s t e r n b l o
2、t验证G e n e c h i pc o - I PG S T - p u l l d o w n相关表型分析相关分子检测肿瘤临床标本检测组织芯片或免疫组化分析 X X X 表达与肿瘤发生 、 转移和预后的相关性X X X n o n - s i l e n c i n g l e n t i v i r u sX X X r e s c u el e n t i v i r u sW e s t e r n b l o t & r e a l - t i m e P C R预实验P a r t . 1P a r t . 2P a r t . 3P a r t . 4R e s c u e
3、实验P a r t . 5X X X 与化疗 、 放疗敏感性关系的分析与实验研究C e l lT i s s u e二、合作项目简介整个文章的研究思路是，在临床病理当中发现在 XX 肿瘤标本中 XXX 基因特异性高表达，在相应的肿瘤细胞系也得到一致的结果，随后选取 2 株典型的细胞系用 XXX 基因的 RNAi 的 lentivirus 获得细胞、整体水平研究数据，了解该基因沉默后对肿瘤增殖，凋亡，侵袭转移能力的影响。最后检测 XXX 基因的下游作用分子，寻找其可能的作用途径。预期文章数据框架:Fig.1 肿瘤病理标本中研究的靶基因呈现表达上调（免疫组化或 qPCR）Fig.2 不同的 XX
4、肿瘤细胞株中该基因的表达也显著增高Fig.3 慢病毒（lentivirus ）结构图，肿瘤细胞感染图片Fig.4 靶基因 RNAi 慢病毒感染肿瘤细胞后，mRNA 和蛋白表达显著下调（ qPCR 和western）Fig.5 在两株细胞上沉默靶基因之后平行的 MTT 结果及统计Fig.6 在两株细胞上沉默靶基因之后流式分析细胞周期，计算凋亡率Fig.7 在两株细胞上沉默靶基因之后克隆形成能力变化，图片和统计结果Fig.8 用肿瘤细胞感染 RNAi 慢病毒制备成稳定细胞株，然后做裸鼠成瘤实验，裸鼠图片，每天量瘤子大小，做肿瘤生长曲线，4 周处死称瘤重，计算抑瘤率。Fig.9 下游基因的 qPCR
5、 检测结果（如果有阳性结果就放上去）Fig.10 western blot 验证上述实验结果三、实验方案1、XXX 在 XX 细胞表达检测实验实验内容：选取多株 XX 细胞株，检测 XXX 基因的表达，高表达 XXX 基因的两株细胞用于后续 RNAi 的研究。1. qPCR 检测不同细胞株中 XXX 的 mRNA 水平；2. 对 XXX 表达阳性的细胞株进行感染预实验，确定各个细胞株病毒感染的难易程度3. 将有 XXX 表达并且容易感染的肿瘤细胞感染 RNAi 病毒并进行 MTT 实验实验目的：确定各细胞 XXX 的表达以及在 MTT 实验中哪株细胞的功能最明显，作为选择相应细胞株进行后续功能
6、实验研究的依据。实验在多株肿瘤细胞上平行进行（如 qPCR 检测发现有细胞低表达 XXX，则该细胞不进入 MTT 实验）项目分组 NC Con RNAiqPCR-XXX（验证）细胞增殖检测（MTT 法）2、XXX 在肿瘤细胞系中的功能研究实验内容：根据预实验的结果选择 12 株细胞系进行 XXX 的相应功能的实验研究，获得一套 in vitro 实验数据。同时在 XXX RNAi 获得功能表型的变化后，重新导入一个突变的XXX 表达病毒载体，使得功能变化得到回复，从而验证 RNAi 反应和基因功能的特异性。实验目的：确定 XXX 基因在肿瘤细胞中的功能Knock Down XXX 功能验证XX
7、X siRNA 病毒 Control NC XXX RNAi组别说明 空白对照 RNAi 阴性对照RNAi 病毒qPCR-XXXWestern-XXX细胞增殖检测（MTT 法）凋亡检测（annexin-v/pi 双染法）克隆形成（克隆形成实验）3、XXX 作用机理研究（下游相关基因检测）实验内容：根据上述的实验结果确定 XXX 的功能后，对其相关基因进行检测（qPCR 或WB 法） ，确定 XXX 作用的信号传导通路。相关基因可以是以前研究报道的，也可以是经典的途径如与凋亡相关的、增殖相关的或侵袭相关的途径实验目的：确定 XXX 的作用机制4、XXX 在动物水平功能研究实验内容：运用慢病毒感染
8、后的肿瘤细胞直接与对照细胞在裸鼠体内成瘤，4 周后比较瘤体大小，计算抑瘤率，也可以采用细胞成瘤后定点注射瘤体的方式进行实验，两种方式互为验证，获得一套高质量的 in vivo 实验数据实验目的：在整体水平验证 XXX 基因在肿瘤成瘤过程中的功能分组 Control NC-1 RNAi-1 NC-2 RNAi-2组别说明 空白对 照 用阴性对照病毒 感染细胞成瘤 用 RNAi 病毒感染细胞成瘤 定点注射阴性对照病毒 定点注射RNAi 病毒5、XXX 表达与临床样本的关系（可用组织芯片技术）实验内容：收集肿瘤组织样本，获得相应的蛋白和 RNA，进行 XXX 表达 Pattern 和表达量分析，临床
9、标本进行免疫组化检测。实验目的：观察 XXX 表达情况和肿瘤的发生、转移、药物敏感性、预后的关系四、候选基因信息：AXXX；CXXX ；EXXX；iXXX；NXXX（仅以以上几个基因为例，我们基因库中已有有效 RNAi慢病毒颗粒）（考虑到科研工作的需要，把具体的基因信息隐去了，还请谅解！）AXXX 2002年才被克隆，属于比较新的基因，它是大肠杆菌 AXXb的同源物，涉及其研究的文章可以检索到的总共大约有 10篇左右，目前主要是停留在研究其作为双脱氧酶可以通过氧化去甲基化催化去除 DNA的 1-methyladenine和 3-methylcytosine，从而起到 DNA修复的作用。该蛋白主
10、要是与双链 DNA结合，2008年的 nature刚刚报道了这种结合的晶体结构。肿瘤方面只见到其在脑肿瘤中有高表达的报道。该基因的研究前景广阔，可以从以下几个方面：1该基因产物在肿瘤中的作用，包括肿瘤的生存、凋亡、对细胞周期的影响、对肿瘤浸润、转移方面的作用。还可研究其是否可以作为肿瘤标记物来辅助临床诊断和治疗。可选择得肿瘤类型可以涵盖各种各样的肿瘤，因为没有同类报道，所有在肿瘤领域的发现都将是“在世界上第一次“。非常适合开展实验。如果有结果出来基本上可以确定该课题组在国际上的领先地位，应该特别容易发文章，申请经费。2由于报道了其与 DNA结合的晶体结构，因此，可以针对这种结构，设计其特异的抑
11、制剂，所合成的抑制剂无论在基础科研还是临床治疗（见 2）领域，均有广阔的应用前景。有巨大的商业前景。CXXX 2003年 12月才被识别，属于比较新的基因，涉及其研究的文章可以检索到的总共大约有 10篇左右，目前主要是停留在组学分析上，对基因的功能知之甚少，只见到 2篇其在 Crohns disease和 ulcerative colitis中有相关性的报道。肿瘤方面未见任何报道。该基因的研究前景广阔，可以从以下几个方面研究：1该基因在正常和肿瘤组织的表达谱如何。适合开展实验。2该基因产物在肿瘤中的作用，包括肿瘤的生存、凋亡、对细胞周期的影响、对肿瘤浸润、转移方面的作用。还可研究其是否可以作为
12、肿瘤标记物来辅助临床诊断和治疗。可选择的肿瘤类型可以涵盖各种各样的肿瘤，如果有结果出来基本上可以确定该课题组在国际上的领先地位，应该特别容易发文章，申请经费。3根据生物信息学分析其属于 cyclin超家族的成员，有 Cyclin box fold，有 Protein binding domain ，该结构参与 cell-cycle 和 transcription 调控。该结构存在于 cyclins, TFIIB和 Retinoblastoma (RB). cyclins 由 8类 cell cycle调节因子组成，可以起调节 cyclin dependent kinases (CDKs)的 作
13、用. TFIIB 是一个可以结合 TATA box的转录因子 . Cyclins, TFIIB 和 RB 各带有两个拷贝的该结构域。基于这些可以参考上述几个分子的功能设计实验，看是否 CXXX也有这些相似的功能。iXXX 是抑癌基因家族中的一个较新的癌基因，直接抑制 p53活性，由于 p53的广泛作用，ixxxx 必然在多种肿瘤中发挥其促癌作用，可以想见其作用的肿瘤类型应当较多，但是目前研究报道尚少。机制方面，与 p53的相互作用，应是重要的研究方向。可以从以下几个方面开展工作：1、该基因在正常和肿瘤的表达谱预实验2、该基因功能作用实验3、与 P53蛋白作用关系及调控机制研究NXXX 1998年被基因定位，属于研究结果比较少的基因，涉及其研究的文章可以检索到的总共几十篇，该基因产物主要是通过与 DNA相互作用发挥调控转录，调节基因表达的作用。在发育过程中起作用。在肿瘤中的作用，到目前为止，未见任何报道。生物信息学分析后发现其在肿瘤与正常组织表达并不算高，两者差别也不大，其在肿瘤发生发展过程中是否发挥重要作用尚不能确定，如果有预实验证明其确实有变化可以尝试研究，所以需要尽快安排系统的肿瘤细胞表达谱检测。
