1、 科研课题申请书课题项目: 申请人: 学号: 单位: 专业申请时间: 2014 年 12 月细胞粘附分子 T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实 T-cad 基因在脑胶质母细胞瘤 C6 细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究 T-cad 基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标本中研究 T-cad 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确 T-cad 基因失活与临
2、床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导 T-cad 分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。关 键 词：T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系, 其发生发展与多种癌基因过度表
3、达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后， 进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。T-cadherin 分子属细胞粘附分子 cadherin 超家族。 Cadherin 超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的 Cadherin 分子如 E-cadherin 和 N-cadherin 由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成
4、，而 T-cadherin 因缺失经典Cadherin 分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名 truncated-cadherin（即 T-cadherin，又称 CDH13 或 H-cadherin） 。近年来对经典的 Cadherin 分子的深入研究发现，E-， N-cadherin 分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10） 。将 E-cadherin 分子重新导入缺失 E-cadherin 分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11） 。近年已开始有 T-cadherin 分子在
5、肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18） ，推测 T-cadherin 分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003 年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将 T-cadherin 基因导入缺失表达 T-cadherin 分子的大鼠脑胶质母细胞瘤 C6 细胞使其过度表达 T-cadherin 分子，C6 细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实 T-cadherin 在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是 T-cadherin 分子通过
6、诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肿瘤细胞于细胞周期 G2 期阻滞。该文发表于 Molecularand Cellular Biology 2003,23:566-578（19） 。这一研究发现为进一步研究 T-cadherin 分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21，22，23） 。T-cadherin 基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致 T-cadherin 基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24） 。T-cadheri
7、n 基因位于染色体 16q24，肝癌的发生与染色体 16q24 的缺失、突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于染色体 16q24 的 13 个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherin mRNA 在 HepG2, PLC/PRF/C,TONG 和 HA22TNGH 四种肝癌细胞株中缺失表达，但 T-cadherin 基因本身并未发生缺失突变（12 ） 。Yu （2002）进一步研究显示 T-cadherin 基因启动子在肝癌中高度甲基化，而 E-cadherin 基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在 Cadherin 细胞粘附分子超家族中 T-cadheri
8、n 基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活密切相关（26） 。这些研究表明 T-cadherin 基因启动子甲基化是 T-cadherin 基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi 在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与 2ug/ml 去甲基化药物 5-aza-2-deoxycytidine 共孵 6 天能使皮肤鳞癌细胞株恢复 T-cadherin 分子表达（17） 。但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导 T-cadherin
9、 分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能，调查缺失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株重新表达 T-cadherin 是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示 T-cadherin 基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导 T-cad
10、herin 分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究 T-cadherin 基因与 C6 细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：1. Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The cadherin superfamily: diversity in form andfunction. J Cell Sci., 2001, 114:629-6412. Kemler R. Classic cadherins. S
11、emin. Cell Biol., 1992,3:149-1553. Koller E, Ransch B. Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells.J Biol Chem.,1996,271:30061-300674. Takeichi M.Cadherin cell adhesion receptor as a morphogenetic regulator. Science1991,251:1451-14555. Angst, B.D., Marcozzi, c., and Mag
12、ee, A.L. The T-cadherinsuperfamily: diversity in fromand function. J.Cell Sci 2001, 114:629-6416. Berx, G., and. Van Roy, F The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper inbreast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001,3:289-293.7. Bremnes, R. M., Veve R., G
13、abrielson, E. et al. High-throughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the E-cadherin pathway in non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2002,20: 2417-2428.8. Handschuh, G., Candidus S., Luber B., et al. Tumour-associated E-cadherin mutations alte
14、r cellular morphology, decrease cellular adhesion and increase cellular motility. Oncogene 1999, 18:4301-4312.9. Levenberg, S., Yarden A., Kam Z., et al. p27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry. Oncogene 1999,18: 869-876.10.Altered expression of E-c
15、adherin in hepatocellular carcinoma : correlation with geneticalteration, beta-catenin expression, and clinical features. Hepatology 2002,36:692-70111.Vleminckx, K., Vakaet L., Mareel Jr. M., et al. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppresso
16、r role. Cell 1991,66:107-119.12. Riou P, Saffroy R, Comoy J, et al. Investigation in liver tissues and cell lines of the transcription of 13 genes mapping to the 16q24 region that are frequently deleted in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2002 Oct;8(10):3178-86.13. Sato, M., Mori, Y., Saku
17、rada, A., et al. The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer. Hum Genet 1998,103:96-10114. Lee, S.W. H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished expression in human breast cancer. Nat. Med 1996,2:776-78215.Zhong,Y., Delgado, Y., Gomez, J., et al. Lo
18、ss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin. Cancer Res22、项目的 研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题一、研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能1.将 T-cadherin 基因导入缺失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株 HepG2，使其表达 T-cadherin 分子，研究表达 T-cadherin 分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化，证实是否 T-cadheri
19、n 重新表达能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。2.将缺失表达 T-cadherin 的 HepG2 细胞和转染后表达 T-cadherin 的 HepG2 细胞于皮下接种裸鼠，在裸鼠肝癌模型上进一步证实 T-cadherin 基因的肿瘤抑制基因功能。3研究 T-cadherin 基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制。证实是否 T-cadherin 在肝癌细胞株存在与在 C6 细胞中一致的分子机制，即 T-cadherin 分子通过诱导 P21CIP1/WAF1 表达致使肝癌细胞于细胞周期 G2 期阻滞。二、在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程
20、度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，在人肝癌中揭示 T-cadherin 基因失活与肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。1.研究 50 例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中 T-cadherin 的表达，揭示 T-cadherin 基因表达水平（失活）与肝癌恶性分化程度、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。2.结合临床病案记录，选择在临床分期、病理类型及治疗方法上具有可比性的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或肝外转移以及 2 年 内未复发或肝外转移的肝癌病例的石蜡标本各 20 例，研究 T-cadherin 基因的表达，揭示 T-cadherin 基因表达水平（失活）与
21、肝癌复发和转移的关系。三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物 5-aza-2-deoxycytidine 是否能重新诱导 T-cadherin 表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的治疗价值和可能的毒副作用。33、拟采取的研究方案及可行性分析一、研究 T-cadherin（T-cad）在肝癌中的基因功能的技术路线1.构建 T-cad 表达载体 pcDNA3.T-cad以脂质体 lipofectin 为载体转染肝癌细胞系 HepG2 细胞以 G418 筛选表达 T-cad 分子的阳性克隆Western blot 鉴定转染后 T-cad 蛋白表达比较表
22、达 T-cad 的阳性克隆与不表达 T-cad 的肝癌细胞的生物学特征:细胞增殖计数 3H 标胸腺嘧啶摄取率测定克隆增殖试验细胞粘试验细胞聚集试验2.在裸鼠肝癌模型上观察 T-cad 阳性克隆与不表达 T-cad 的肝癌细胞的生物学特征a.裸鼠皮下分别接种 107T-cadherin（+）或（-）的肝癌细胞（各20 只）b.观察：肿瘤生长速度肿瘤转移发生的时间、累及积器官及频率裸鼠的生存期3.研究 T-cadherin 基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制a.流式细胞仪检测表达 T-cadherin 阳性和阴性的肝癌细胞的细胞周期变化b.Western blot 检测细胞周期调控蛋白 p53,p
23、21,p27,cyclin D 的表达变化c.研究是否 T-cadherin 分子在肝癌中同样存在诱导 P21 CIP1/WAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期 G2 期阻滞的分子机制。二、研究 T-cadherin 基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系的技术路线1. 收集临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织各 50 例a. 检测 T-cadherin 表达： 定量 PCR；免疫组织化学；Western blotb.比较肝癌与癌周肝组织中 T-cadherin 的表达水平，研究 T-cadherin 缺失表达（基因失活）与人肝癌发生的关系。c. 比较不同病例肝癌中 T-c
24、adherin 的表达水平，研究 T-cadherin 表达水平与肿2. 瘤病理分级、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。2.结合临床病案记录，选择临床分期相同、病理类型一致、单个肿瘤大小在 25cm 之间、无肝内外转移、行根治性切除后采用同样的治疗方案的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或转移以及 2 年内未复发或转移的肝癌石蜡标本各 20 例a. 检测 T-cadherin 表达： 免疫组织化学b. 回顾研究 T-cadherin 表达水平与肿瘤复发和转移的关系三、研究去甲基化药物诱导 T-cadherin 表达及其治疗学意义的技术路线。1.研究表明 T-cadheri
25、n 在肝癌细胞株 HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和 HA22TNGH 中缺失。采用 Herman 已报导的检测 T-cadherin 启动子甲基化和非甲基序列的引物，进一步证实 T-cadherin 在上述肝癌细胞株中的启动子甲基化现象。扩增甲基化序列引物，上 游 5-TCGCGGGGTTCGTTTTCGC-3，下游 5-GACGTTTTCATTCATACGCG-3，扩增非甲化序列引3. 物，上游 5-TTGTGGGGTTGTTTTGT-3，下游 5-AACTTTTCATTCATACACACA-3。 采用 Western blot 进一步证实 T-cadherin 在上述存在的
26、启动子甲基化肝癌细胞株中蛋白水平表达缺失。2. 选 择 T-cadherin 启 动 子 高 度 甲 基 化 的 细 胞 株 与 去 甲 基 化 药 物 5-aza-2-deoxycytidine（2ug/ml）作用 6 天后，采用 Western blot 检测 T-cadherin 蛋白水平表达; 采用细胞增殖计数、 3H 标胸腺嘧啶摄取率测定、克隆增殖试验、细胞粘附试验和细胞聚集试验检测 T-cadherin 表达前后肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化。3.将 T-cadherin 启动子高度甲基化的细胞株（细胞数 1x107）分别接种 60 只裸鼠后随机分成两组（每组 3
27、0 只） ，治疗组再分成五组（每组 6 只） ，每组分别按 0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug/克体重每日皮下注射 5-aza-2-deoxycytidine，共注射一周，对照组仅注射生理盐水，观察不同组裸鼠的肿瘤生长速度、肿瘤转移发生的时间、累及器官及频率及裸鼠的生存期。4、项目的特色及创新之处1近年已开始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌、肺癌及结直肠癌中表达显著下降、缺失的报导，推测 T-cadherin 分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色。 申请人（黄志勇）最新研究首次证实 T-cadherin 在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并首次揭示其肿瘤抑制功能
28、的分子机制（Huang Zhiyong 等，Molecular andCellular Biology 2003,23:566-578） 。但目前尚无人对 T-cadherin 在肝癌中的基因功能及其分子机制进行研究。基于申请人前期世界领先的研究工作基础，该研究将进一步揭示 T-cadherin 分子在肝癌中的基因功能和其分子机制，具有世界先进性和独创性。2. Cadherin 分子，如 E-，N-cadherin 分子缺失或突变与多种肿瘤的发生及转移特征密切相关，但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌的侵犯及转移等生物学特征的关系目前尚无研究，该研究具有先进性和独创性。3.T-cadherin 基因启动子甲基化在肝癌中具有特异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活密切相关。但对应用去甲基化药物诱导 T-cadherin 表达并研究其对肝癌的治疗学意义目前尚无研究。该研究具有创新性和实用性。4.该研究的独到之处在于揭示最新肿瘤抑制基因 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系以及去甲基化药物对肝癌的治疗作用，该研究对进一步揭示肝癌发生发展的分子机制、研究更有效的治疗药物具有重要的科学及临床意义。
