1、专题26 基因工程,高考生物 (新课标专用),1.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1), 拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。,五年高考,下列操作与实验目的不符的是 ( ) A.用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒 B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞 C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞 D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上,答案 C 本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoR 的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoR和DNA连接酶构建
2、重组质粒;用含C基因的农杆菌 侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基 因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子 杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。,2.(2018课标全国,38,15分)回答下列问题: (1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌 细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了 (答出两点即可)。 (2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的 方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体 DNA通常需与 组装成
3、完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体 DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是 。 (3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防 止蛋白质被降解,在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的 过程中应添加 的抑制剂。,答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶,解析 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质 粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细
4、胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗 传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态, 即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌, 故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用 不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保 护蛋白质不被水解。 知识归纳 目的基因导入受体细胞的方法 (1)若受体细胞为植物细胞:基因枪法、花粉管通道法、农杆菌转化法。 (2)若受体细胞为动物细胞:显微注射法。 (3)若受体细胞为大肠杆菌:感受态细胞法。
5、,3.(2018课标全国,38,15分)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一 特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP基因的5末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载 体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相 同。,回答下列问题: (1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是 。使用这 两种酶进行酶切是为了保证 ,也是为了保证 。 (2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说
6、明L1基因在牛 的皮肤细胞中完成了 和 过程。 (3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。 (4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应 分别以该牛不同组织细胞中的 (填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模 板。,答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细 胞 (4)核DNA,解析 (1)构建基因表达载体时,使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的 两种限制酶,可以防止自身环化,并且保证融合基因和质粒正
7、确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观 察到绿色荧光,说明L1基因已经表达,即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基 因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的 不同组织细胞中是否含有融合基因,需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板,用PCR方法 进行鉴定。,4.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了 -淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列 问题:(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先获得细菌的 。 (2)为了便于扩增的DNA片段与表
8、达载体连接,需在引物的 端加上限制性酶切位点, 且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是 。,(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中 的设定与引物 有关, 的设定与扩增片段的长度有关。(填序号) 变性温度 退火温度 延伸温度 变性时间 退火时间 延伸时间 (4)下图表示筛选获得的工程菌中编码-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列: 5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3 图中虚线框内mRNA片段包含 个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第 一个密码子最多有 种。 (5)获得工程菌表达的-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以
9、浓度为1%的可溶性淀粉为底 物测定酶活性,结果如下:,根据上述实验结果,初步判断该-淀粉酶活性最高的条件为 。,答案 (8分) (1)基因组DNA (2)5 使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连 (3) (4)8 13 (5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tirs-HCl,解析 (1)由题干信息可知某种海洋细菌含有-淀粉酶基因,因此在扩增-淀粉酶基因前需先 从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接 到引物上时,是与引物的3端相连的,由此确定需在引物的5端加上限制性酶切位点。常在两 条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片
10、段能定向插入表达载体,防止自身 相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与 扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA 上5端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基, 可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子已经固定为U,因此还有2个碱基未知, 共可能有的种数为44=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码 子最多有13种。(5)据表格数据可知:-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条 件下相对活性
11、为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。,5.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2 017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。 (1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录 成对应DNA后,利用 技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码 氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不 能合成完整长度的 ,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因 分别构建重组质粒,并保存。 (2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿
12、主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密 码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与 连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的 进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上 述tRNA的转基因宿主细胞。 (3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加 的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病 毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。,特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是 (单选)。 A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶 C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的R
13、NA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫 苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起 免 疫,增强免疫保护效果。,答案 (共14分) (1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)细胞,解析 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个 别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终 止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连 接后才能导入宿主细胞
14、。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达 题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tR- NA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需 补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合 酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。 疑难突破 (1)由(1)中“个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列”可知,改造后 的基因表达时不能合成完整长度的多肽。 (2)由(2)中特殊tRNA能与终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基
15、酸(Uaa)可知,转基因 宿主细胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培养基中需加入非天然氨基酸Uaa。 (3)灭活了的病毒已不具有侵染性,因此,只能引起体液免疫;而具侵染性的病毒可引起细胞免 疫。,6.(2017课标全国,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物 没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子) 可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题: (1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原 因是 。 (2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选
16、用 作为载体, 其原因是 。 (3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有 (答出两点即可)等优点。 (4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是 (填“蛋白A 的基因”或“蛋白A的抗体”)。 (5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基 因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是 。,答案 (1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被 切除,无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4
17、)蛋白A的抗体 (5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,解析 本题主要涉及基因文库与cDNA文库的差异、基因工程的步骤、基因工程产物的检测 方法等知识,意在考查考生提取知识、分析和归纳知识的能力。 (1)真核生物和原核生物的基 因结构不同,真核生物的基因中存在内含子等不能编码蛋白质的序列,原核生物的基因中不存 在内含子。真核生物在基因表达时,转录出的RNA需要将内含子对应的RNA序列切除后才可 进行翻译。从人的基因组文库中获得的基因 A 中含有内含子,而作为原核生物的大肠杆菌不 能切除内含子对应的RNA序列,故基因 A 在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。 (2)病毒对宿主细 胞的侵染具
18、有特异性,噬菌体是专门侵染细菌的病毒,不能侵染家蚕细胞,故可选用可感染家蚕 的昆虫病毒作为载体。 (3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗 传物质相对较少等优点,因此在基因工程中常用原核生物作为受体细胞。(4)检测基因A 是否 翻译出蛋白A,一般用抗原抗体杂交的方法,即用蛋白 A 的抗体与从细胞中提取的蛋白质进 行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是 S型菌的 DNA 进入 R 型菌 体内,并可在 R 型菌体内完成表达,这证明了 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个 体,为基因工程奠定了理论基础。,知识拓展 真核生物基因中通常有内含子,原核
19、生物的基因中不含有内含子,原核生物不能切 除内含子转录的RNA序列,故基因工程中不能将真核生物的基因直接导入原核生物,而常使用 反转录的方法先获得真核生物的cDNA(不含内含子),再进行下一步操作。,7.(2017课标全国,38,15分)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分,几丁质酶可催化几丁质水 解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内,可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题: (1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA,常选用嫩叶而不选用老叶 作为实验材料,原因是 。提取RNA时,提取液中需添加RNA酶抑制 剂,其目的是 。 (2)以mRNA为材料可以获得cDNA,其原理
20、是 。 (3)若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细 胞,原因是 (答出两点即可)。 (4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键是 。 (5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提 高,根据中心法则分析,其可能的原因是 。,答案 (1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按 照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目的基因无复制原点;目的基因无表达所需启动 子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常,解析 本题主要考查基因工程的相关知识
21、,考查学生获取知识,分析与归纳知识等能力。(1)从 植物体中提取mRNA需要破碎组织细胞,嫩叶比老叶的组织细胞易破碎,mRNA提取效率高。 由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解,所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低 RNA酶的活性,保护提取的RNA不被分解。(2)cDNA是在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板, 按照碱基互补配对的原则合成的。(3)由于目的基因无复制原点,也无基因表达所需的启动子 和终止子,所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接酶可以催化两个DNA 片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组 中,但是转基因植
22、株抗真菌病的能力没有提高,说明转基因植株体内不存在抗菌活性蛋白,即几 丁质酶基因的转录或翻译过程出现异常,从而导致几丁质酶基因没有正常表达合成抗菌活性蛋白。 知识归纳 走出基因工程的5大易混点 (1)限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别特定的碱基序列,并在特定的位点上进行切割; 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已 经被修饰。,(2)切取目的基因与切割载体时“只能”使用“同一种酶”? 在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端。 但如果用两 种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连
23、 接起来。 为了避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,可使用不同的限制酶切割目的基因和质 粒,使目的基因和载体各具有两个不同的黏性末端。 (3)启动子起始密码子,终止子终止密码子 启动子:一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部 位。 终止子:一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾端。 作用是使转录过程停止。 起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。 (4)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因的插 入位点应在启动子与终止子之间,若目的基因插在启动子内部,启动子将失去原功能。 (5)基因工
24、程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。第,一步用PCR或人工合成法获得DNA过程中存在碱基互补配对,第二步黏性末端连接时存在碱 基互补配对,第四步分子杂交及基因表达时存在碱基互补配对。,8.(2017课标全国,38,15分)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组 成,编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成,如图1所示。回答下列问题: (1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙,若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列 (TTCGCTTCTCAGGAAGGA),则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙, 原因是 。 (2)某同
25、学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中,在PCR反应体系中加入了DNA聚合,酶、引物等,还加入了序列甲作为 ,加入了 作为合成DNA的原料。 (3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白,要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴 细胞增殖的作用,某同学做了如下实验:将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组,其中 三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一组作为对照,培养并定期检测T淋巴细胞浓度,结果 如图2。 由图2可知:当细胞浓度达到a时,添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加,此时若要 使T淋巴细胞继续增殖,可采用的方法是 。细胞培养过程中,培养箱中 通常要维持一定的CO2浓度,CO
26、2的作用是 。 仅根据图1、图2可知,上述甲、乙、丙三种蛋白中,若缺少 (填“A”“B”“C” “D”或“E”)片段所编码的肽段,则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。,答案 (1)编码乙的DNA序列起始端无ATG,转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 dNTP (3)进行细胞传代培养 维持培养液的pH C,解析 本题主要考查基因工程技术和动物细胞培养技术的相关知识。(1)由题干中编码蛋白 乙的DNA序列可知,编码乙的DNA序列起始端无ATG,转录出的mRNA上没有起始密码子 AUG。(2)PCR需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、DNA模板、四种游离的脱氧核 苷酸等。(3)动物细胞培
27、养中,细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点,当细胞浓度达到a时, 若要使T淋巴细胞继续增殖,需要在培养基中加入胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理贴壁生长的细 胞并分瓶进行传代培养;动物细胞培养过程中,需要在培养箱中通入一定浓度的CO2,CO2的作 用是维持培养液的pH。由图2可知,加入蛋白丙刺激T淋巴细胞增殖的效果明显比加入蛋白 甲、乙时低;结合图1中蛋白丙与蛋白甲、乙的DNA序列可知,缺少C片段所编码的肽段,会明 显降低蛋白刺激T淋巴细胞增殖的效果。 知识拓展 认识dNTP dNTP是脱氧核糖核苷三磷酸的缩写,是dCTP、dATP、dGTP、dTTP的统称。“d”代表脱氧, “N”代表变量A、T、C
28、、G中的一种。dNTP可作为生物DNA合成以及PCR过程的原料。,9.(2017天津理综,9,12分)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状, 但难以直接培育成转基因植株,为使其获得抗除草剂性状,需依次进行步骤、试验。 .获得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线如下图。(1)为防止酶切产物自身环化,构建表达载体需用2种限制酶,选择的原则是 (单选)。 Ti质粒内,每种限制酶只有一个切割位点 G基因编码蛋白质的序列中,每种限制酶只有一个切割位点 酶切后,G基因形成的两个黏性末端序列不相同 酶切后,Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同 A. B. C. D.,(2)下表是4种玉米
29、自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知,细胞脱分化时使用的激 素是 ,自交系 的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。,(3)农杆菌转化愈伤组织时,T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组 织,需使用含 的选择培养基。 (4)转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生 长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达,其产物能催化无色物质K呈现蓝 色。用K分别处理以下愈伤组织,出现蓝色的是 (多选)。 A.无农杆菌附着的未转化愈伤组织,B.无农杆菌附着的转化愈伤组织 C.农杆菌附着的未转化愈伤组织 D.农杆菌附着的转化愈伤组织 (5)
30、组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交,在子代含G基因的植株 中,纯合子占 。继续筛选,最终选育出抗除草剂纯合自交系A。,答案 (共12分)(1)A (2)2,4-D 乙 (3)除草剂 (4)BD (5),解析 .(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载体)发生自身环 化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点,含 目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。(2)细胞脱分化形成 愈伤组织。表格信息显示,使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚,不仅要易脱分 化,而且还要易再分化生芽
31、、生根,故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建 的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段 上),因利用农杆菌转化法转基因时,只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上,故需使用含除 草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确 表达”,只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织,用K处理后出现蓝色,故选BD。(5)转 基因植株相当于携带G基因的杂合子,转基因植株自交,后代有3/4植株携带G 基因,其中纯合子 占1/3。,易错警示 转基因植物培育过程中,筛选成功转化的植物受体细胞的标准 利用农杆菌转
32、化法完成植物细胞转基因时,因只有Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞染色体 DNA上,故筛选转化的植物受体细胞只能借助T-DNA片段上的特殊基因作为筛选标准,而Ti质 粒上的非T-DNA片段未导入植物受体细胞,在对转化后的受体细胞筛选时不以此作为选择标 准。,10.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划 通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处 理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过 获得 用于PCR扩增。 (2)设计一对与MT基因两端
33、序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物,中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ,而造成引物自连。 (3)图中步骤1代表 ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。 (4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基 配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但 的引物需要设 定更高的退火温度。 (5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有 (填序号:升高退 火温度 降低退火温度 重新设计引物)。,答案 (8分)(1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性
34、 (4)引物与 模板 GC含量高 (5),解析 本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析, mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2) 构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的 位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变 性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的 DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物 与模板结合;引物设计不合理也会
35、影响PCR扩增反应。 知识归纳 关于引物的几个问题:引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基 序列互补配对,其长度通常为2030个核苷酸。由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温 度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它 关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。结合DNA结构特点,A 与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中 含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。,11.(2016课标全国,40,15分,0.587)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Amp
36、r或Tetr中会导 致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒 载体用BamH酶切后,与用BamH酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反 应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的 大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质 粒的大肠杆菌。回答下列问题:(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有 (答出两点即可),而,作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细
37、胞中,未被转化的和仅含 环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是 ; 并且 和 的细胞也是不能区分的,其原因是 。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的 基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有 的固体培养基。 (3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自于 。,答案 (1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了 目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上 均能生长 四环素 (3)受体细胞,解析 (1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复制
38、、具有标记基因、含有一至多个限 制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青 霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以 含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上 生长,但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛 选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程 中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。,评分细则 (1)能自我复制
39、(具有复制原点,具有复制起始位点),具有标记基因(具有抗性基因), 具有限制性核酸内切酶酶切位点(限制酶酶切位点),以上每个得分点2分,任选2个即可得4分, 答出一点给2分。 (2)二者均不含氨苄青霉素抗性基因Ampr,在该培养基上均不生长(2分),不含抗性基因为关键 词。含有质粒载体(2分),含插入了目的基因的重组质粒(含重组质粒)(2分),此两问不分先后顺 序。二者均含氨苄青霉素抗性基因Ampr,在该培养基上均能生长(2分),含有抗性基因为关键 词。四环素/Tet(1分),中英文均可得分。 (3)受体细胞/宿主细胞(2分)。,12.(2016课标全国,40,15分,0.442)图(a)中的
40、三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH 和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体 上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。图(a)图(b),根据基因工程的有关知识,回答下列问题: (1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理 由是 。 (2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所 示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。图(c),(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有 和 , 其中既能连接黏性末端又
41、能连接平末端的是 。,答案 (1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分) (2)甲和丙(2分) 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二 者的目的基因均不能被转录(3分,其他合理答案可酌情给分) (3)EcoliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给 分),解析 (1)分析图(a)可知,限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这 两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基 因能在宿主细胞中成功表达,目的基因应插入在启动子
42、和终止子之间,据此可判断甲、丙均不 符合要求,目的基因均不能表达。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶, 其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。 评分细则 (1)第一空答其他两种酶不给分。第二空答“两种酶切割后形成的黏性末端可互 补”给全分。 (2)第二空原因答作“目的基因应插入至启动子与终止子之间”也给分。 (3)第一空、第二空顺序可颠倒,第三空答案唯一。,13.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。 如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因,首先需采集
43、人的血液,提取 合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使 用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头 在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选 择的启动子是 (填写字母,单选)。 A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子 C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子,(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是 。 (4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相 比,选择途径获取rHSA的优势是 。 (5)为证明
44、rHSA具有医用价值,须确认rHSA与 的生物学功能一致。,答案 (12分)(1)总RNA(或mRNA)(2)B (3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化 (4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工 (5)HSA,解析 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的,所 以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA复制,DNA复制时,两条子链的延伸 方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表 达,需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体
45、细胞,使农杆菌 Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,有利于目的基因成功 转化。(4)大肠杆菌为原核生物,无内质网和高尔基体,不能对多肽进行高效加工,而水稻是真 核生物,具有内质网和高尔基体,可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值,须 确认rHSA与HSA的生物学功能一致。 易错警示 注意PCR技术的原理是DNA复制,DNA复制时,两条母链分别作为模板,新合成的 两条子链延伸的方向相反,由此确定引物的位置及扩增方向。,14.(2015课标,40,15分,0.4173)已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由3 05个氨基酸组成
46、。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨 酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题: (1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的 进行改造。 (2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包 括 的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即 。 (3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过 和 ,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再 经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物
47、 进行鉴定。,答案 (1)氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分) (2)P P1(每空2分,共4分) DNA和RNA(或遗传物质)(2分) DNARNA、RNADNA、 RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分) (3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列(每空2分,共4分) 功能(1分),解析 (1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对其结构进行改造。(2)确 定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心 法则的内容包括遗传信息的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预 期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测
48、氨基酸序列,进而确定相对应的脱氧核苷酸 序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。 解题关键 理清蛋白质工程的基本途径、中心法则的全部内容图解是解答本题的关键。,以下为教师用书专用,15.(2014课标,40,15分,0.5599)植物甲具有极强的耐旱性,其耐旱性与某个基因有关。若从该 植物中获得该耐旱基因,并将其转移到耐旱性低的植物乙中,有可能提高后者的耐旱性。 回答下列问题: (1)理论上,基因组文库含有生物的 基因;而cDNA文库中含有生物的 基因。 (2)若要从植物甲中获得耐旱基因,可首先建立该植物的基因组文库,再从中 出所需的 耐旱基因。 (3)将耐旱基因导入农杆菌,并通过农杆菌转化法将其导入植物 的体细胞中,经过一系 列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达,应检测此再生植株 中该基因的 ,如果检测结果呈阳性,再在田间试验中检测植株的 是否得到提 高。 (4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交,子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为31时,则 可推测该耐旱基因整合到了 (填“同源染色体的一条上”或“同源染 色体的两条上”)。,
