1、药物性肝损伤生物标志物研究进展 刘小茜 吴文晓 耿兴超 李波 中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中 心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室 摘 要： 药物性肝损伤 (drug-induced liver injury, DILI) 是药物不良反应和药物撤 市或限制使用的主要原因。 生物标志物检测是临床前药物肝毒性评价和临床患者 潜在肝损伤诊断的重要技术手段。 随着组学技术的快速发展和肝损伤机制研究的 不断深入, 关于新型 DILI生物标志物研究报道也越来越多。本文综述了近年来 国内外DILI生物标志物研究的最新进展, 以期为更好地评价药物潜在的肝毒性 风险提供参考, 为临床肝损伤诊断
2、提供依据。 关键词： 药物性肝损伤; 生物标志物; 组学技术; 肝损伤机制; 作者简介： 刘小茜, 女, 硕士研究生, 主要从事药物安全性评价研究。 联系电话: (010) 67876255, E-mail:xiao_。 作者简介：耿兴超, 男, 博士, 研究员, 主要从事药物安全性评价研究。联系电 话: (010) 67876255;E-mail:。 作者简介：李波;男, 研究员, 博士生导师, 主要从事药物安全性评价研究。联 系电话: (010) 53851706, E-mail:。 基金：国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目 (2015ZX09501004-002, 2015ZX09
3、501007-004) Research progress of biomarkers of drug-induced liver injury LIU Xiao-qian WU Wen-xiao GENG Xing-chao LI Bo Beijing Key Laboratory, National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institute for Food and Drug Control; Abstract： Drug-induced liver injury (DILI) is the main cause o
4、f adverse drug reactions, and drug withdrawal or restrictions.Biomarkers are important tools for evaluating preclinical drug hepatotoxicity and clinical diagnosis of potential liver injury in patients.In recent years, with the rapid development of omics technology and the development of mechanism re
5、search of of liver injury, there were more and more reports on new DILI biomarkers.In this paper, recent advances in the research of DILI biomarkers at home and abroad were reviewed, which could provide references for better evaluation of the potential risk of hepatotoxicity and clinical diagnosis o
6、f liver injury. Keyword： drug-induced liver injury; biomarker; omics technology; mechanism of liver injury; 药物性肝损伤 (drug-induced liver injury, DILI) 是药物不良反应和药物撤 市或限制使用的主要原因之一, 也是药物开发过程中面临的一项严峻的挑战。 如 何更准确地评价临床前药物的肝损伤风险, 对于新药研发和临床风险控制显得 尤为重要。生物标志物一直是检测肝损伤非常直接有效的技术手段。虽然目前临 床主要依靠谷丙转氨酶 (ALT) 、谷草转氨酶 (AST)
7、 、碱性磷酸酶 (ALP) 等酶 学指标诊断肝损伤, 但由于它们缺乏诊断的特异性和灵敏性, 往往使诊断变得 困难, 对于临床前评价来说更是如此, 急需探索一些新的具有高特异性、 高灵敏 度的生物标志物用于 DILI检测。随着分子生物学技术的快速发展和肝损伤机制 研究的不断深入, 越来越多的新型 DILI生物标志物被不断地发现和报道。 因此, 本文总结了近年来 DILI相关生物标志物的发展状况, 希望能够在毒理学研究中 为更好评价药物潜在的肝毒性风险提供参考, 为临床肝损伤诊断指标的选择提 供依据。 1 基于组学技术发现的新型生物标志物 1.1 蛋白质组学生物标志物 1.1.1 血红素加氧酶 1
8、 (heme oxygenase-1, HMOX1) HMOX1是一种氧化应激诱导型血红素加氧酶, 是血红素代谢过程中的限速酶。近 年来, 许多研究发现 HOMX-1与肝损伤有关。 Gao等1利用O/O标记和 2D-LC-MS 技术分析了大鼠给予对乙酰氨基酚 (acetaminophen, APAP) 低剂量 (100 mgkg) 和高剂量 (1 250 mgkg) 后6 h 和24 h的肝组织, 结果发现有 31 种蛋白的丰度的改变与肝毒性相关, 其中HMOX1 在血浆中的浓度升高非常明显。 进一步通过小鼠的APAP肝损伤试验进行验证, 给予300 mgkg剂量的APAP, 24 h后用EL
9、ISA的方法检测HMOX1的浓度, 其浓度升高大约是空白对照组的11倍, 而且其浓度与肝损伤的严重程度相关。Kemelo 等2研究发现在D-半乳糖胺/脂 多糖诱导的Wistar 大鼠肝损伤中, D-半乳糖胺/脂多糖能上调HMOX1 水平。 HMOX-1 是细胞在应激时诱导表达的具有抗氧化作用的酶, 有保肝作用, 甚至成 为了治疗许多肝疾病的新靶点。HMOX-1在临床前和临床检测肝损伤上可以作为 潜在的生物标志物, 帮助预测和诊断急性肝损伤, 不过其与多种疾病相关, 特 异性不是很强。 1.1.2 精氨琥珀酸合酶 (argininosuccinate syn-thetase, ASS) ASS能
10、够催化瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸, 然后在精氨琥珀酸裂解酶的 作用下, 生成精氨酸。Prima等3在各种急性肝损伤模型中使用 ELISA 方法检 测ASS, 发现在肝缺血再灌注模型中, ASS在肝损伤早期的敏感性和动态变化范 围都远超ALT和AST, 并且在四氯化碳 (CCl4) 的肝损伤模型中, 给药 1 h后, ASS的血清含量迅速上升, 并持续升高至给药 24 h后, 而ALT在给药 1 h后没 有明显升高, 在24 h 仅升高为对照组的6倍。表明 ASS比AST更灵敏。Qin等 4对暴露于 APAP或 CCl4的C57BL/6J和NOD/Shi Lt J 小鼠的血浆中的 81种肝
11、富集蛋白进行定量分析, 发现了49种差异蛋白, 并通过Western-blot的方法验 证了4 种蛋白, 其中也包括了 ASS1。ASS1在大鼠肝门静脉周围表达, 而在人的 肝中则不集中分布。 虽然 ASS在肝脏和肾脏都有分布, 但肝中ASS的含量是大于 肾脏的。特异性不强, 但是对肝损伤判断有代表性。同时, ASS更可能是诊断急 性肝损伤比ALT更敏感的标志物。 所以在临床前研究和临床诊断中对急性肝损伤 的判断是有价值的。 1.1.3 脂肪酸结合蛋白 1 (fatty acid-binding protein1, FABP1) FABP1是一种细胞内的脂质结合蛋白, 涉及脂肪酸的摄取、转运和
12、代谢过程。 FABP1在肝中的含量丰富, 当肝细胞损伤时, 它被释放到血液循环中。Mikus等 5应用一种类似于蛋白质组学的抗体磁珠序列的方法, 直接对临床 DILI患者 的血清样本中的蛋白进行分析, 结果发现DILI 组中FABP1水平升高显著。 其中, FABP1与 ALT相比在组织分布和动力学方面有更突出的特点。此外, 免疫组化检 测发现FABP1并不在骨骼肌和心肌中表达, 具有较好的分布特异性, 这也是 FABP1比 ALT更有优势的地方。同时, 市场上有人和动物相关的FABP1 的ELISA 检测试剂盒, 这为临床前和临床上的检测提供了便利, 或许可以作为 ALT检测 的一个补充,
13、提高诊断肝损伤的特异性和准确性。 1.1.4 精氨酸酶-1 (arginase-1, ARG1) 、谷胱甘肽-S-转移酶 A (gultathione-S-transferases, GSTA) 和羟基苯丙酮酸双加氧酶 (hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPD) ARG1是肝脏中催化水解 L-精氨酸生成鸟氨酸与尿素的反应酶;GSTA 是谷胱甘肽 结合反应的关键酶, 催化谷胱甘肽结合反应的最初步骤。Bailey等6研究发现: 这3种生物标志物无论是单独还是与ALT一起评价, 都比ALT单独检测具有更高 的特异性和敏感性。其中, ARG1在检测胆管损伤方面灵敏
14、度最高, GSTA 结合ALT 在检测肝细胞空泡化方面更具有敏感性, HPD 与ALT结合可以提高肝细胞肥大检 测的灵敏度。 这3种生物标志物与 ALT的结合提高了肝损伤不同类型诊断的特异 性。而这些在临床前研究和临床的应用上还很少, 还需要后续实验进行验证。 1.2 代谢组学生物标志物胆酸 (cholic acid, CA) 、甘氨胆酸 (glycocholic acid, GCA) 和牛磺胆酸 (taurocholic acid, TCA) 肝脏是一个重要的代谢器官, 参与了许多化合物的代谢和排泄过程。 代谢组学通 过对某生物或细胞在一特定生理时期内所有低相对分子质量代谢产物同时进行 定性
15、和定量分析, 研究发现与疾病或特殊处理引起的相关代谢图谱的变化7。 胆汁酸 (bile acids, BAs) 虽然也一直作为传统生物标志物使用, 但是关于胆 汁酸中单独成分作为标志物研究的报道却很少, 而单个胆汁酸成分的变化规律 或许是区分不同类型肝损伤的手段。Yamazaki 等8研究证明BAs平衡紊乱是 DILI早期发生的一个关键改变。 Luo等9应用液质联用 (LC/MS) 的方法对药物 肝损伤动物模型中3种胆汁酸CA, GCA和TCA作为潜在的生物标志物价值进行评 估, 并与传统的生物标志物 ALT, AST, GLDH 和BAs进行比较, 发现在肝细胞坏 死时, 这 3种胆汁酸都显
16、著升高, 同时也观察到传统生物标志物的升高。 而当动 物给予仅引起胆管增生的药物后, 结果发现结合胆汁酸 GCA和TCA升高, CA无 显著变化。当没有其他标志物的改变时, GCA 和TCA可能是检测胆管增生的生物 标志物。而产生肝细胞损伤时, 主要是CA升高。在临床前和临床应用上, 由于 CA是肝细胞损伤时升高, 其可以与ALT, AST 等共同来评价肝损伤, 或许可以提 高准确度, 而GCA和 TCA可以帮助检测胆管增生, 提高诊断的特异性。 1.3 基因组学生物标志物 1.3.1 有机阴离子转运多肽 (organic anion-trans-porting polypeptide, OA
17、TP) mRNA 近年来, 有研究发现了药物转运体作为 DILI 生物标志物的价值。OATP 是肝脏药 物摄入转运体中的一种, 在体内药物的肝胆转运中有重要作用。Donato 等10 建立了“三明治”大鼠肝细胞培养模型, 并分别用胆汁淤积和非胆汁淤积的药 物 (如脂肪变性、非肝毒性药物等) 进行处理, 研究了10种摄入和外排的胆道 转运体的mRNA的表达。结果发现能引起胆汁淤积和脂肪变性的药物都会影响大 多数肝胆转运体的表达, 进一步研究发现它们共同的特征是抑制了 OATP1A1的 表达, 并通过 ROC曲线分析, OATP1A1 mRNA 在确证胆汁淤积和脂肪变性药物方 面具有很高的敏感性
18、(0.917) 和特异性 (0.941) 。OATP1A1 mRNA 可作为早期 药物研发中预测引起胆汁淤积或脂肪变性药物的一个生物标志物。 由于其在人体 器官中没有分布, 主要在大鼠肝和肾中存在, 所以不适合应用到临床, 较适合 于药物非临床研究的体内和体外实验。 1.3.2 微核糖核酸 (MicroRNA, miRNA) miRNA是短的非编码单链RNA, 长度大约为22个核苷酸, 主要调控转录后的基因 表达11。 有研究发现 miR-122和miR-802作为 DILI的生物标志物有很大价值。 Wang等12通过小鼠 APAP急毒模型发现miR-122水平与对照组相比明显升高, 并且比A
19、LT出现得更早, 而且在肝组织中表达丰富。Starckx等13在3个不同 肝毒性化合物的大鼠急毒试验中也发现了 miR-122明显升高, 并与其他生物标 志物的升高和组织病理学肝损伤的评价一致。 这些都说明miR-122比ALT更灵敏。 目前, miR-122作为肝损伤生物标志物得到越来越多的认可。miR-122 除了在肝 组织特异表达外, 在外周血中也可以检测, 有望在临床上弥补ALT, AST 的肝损 伤检测灵敏度和特异性低等方面的不足。 另外, 还有研究发现 miR-802可以成为肝胆管损伤的潜在标志物, Wolenski 等 14在大鼠APAP或CCl4的毒性实验中发现血清中miR-8
20、02水平的升高与miR-122 升高的程度相当。在 Church等15的药物致肝胆损伤实验中也发现 miR-802-5p 的水平与对照组相比显著升高。同时, miR-802在肝中含量丰富, miR-802对肝 胆管损伤的检测是有帮助的。 这对临床前的药物肝胆管损伤的评价和临床诊断或 许有帮助, 不过还需要进一步探索其特异性和灵敏度。 1.3.3 差异表达基因 1.3.3. 1 Zwint, Abcc3 和Ppp1r3b基因 由于单一实验可能具有假阳性和片面性, 因此有研究采用大数据分析的方法来 研究潜在的DILI标志物。Cho等16利用一种 Meta分析的方法对59 种DILI研 究的数据集进
21、行分析, 发现了3种重要的差异表达基因 Zwint, Abcc3 和 Ppp1r3b。Zwint基因主要调控着丝粒;Abcc3 可能在胆道和肠道排泄的有机阴离 子运输中发挥作用, 并参与了多药耐药;Ppp1r3b 调节糖原, 主要在肝脏和骨骼 肌中表达。 并通过体外Hep G2肝细胞APAP过量损伤模型进行验证, 使用qRT-PCR 和RT-PCR 检测基因表达变化情况, 结果发现上述 3种差异基因表达的改变与前 期的发现一致:Zwint, Abcc3 明显上调, Ppp1r3b 明显下调。目前, 这种基于大 数据分析的方法应用得越来越多, 可能比单一的研究更有可信度和说服力, 这 3种基因的
22、应用价值仍需后续的实验进行验证。 1.3.3. 2 基因表达水平总体评分 Yano等17通过多种肝毒性和非肝毒性药物开展小鼠体内DILI研究, 发现肝中 S100A8, S100A9, NALP3, RAGE 和IL-1的 mRNA表达水平可能是DILI 的生物 标志物。其中, S100A8 与S100A9属于钙结合蛋白 S100蛋白家族, 而NALP3是 一种炎性体。 通过基于免疫和炎症相关因子指标的白血病 HL-60体外细胞评价模 型对这5个生物标志物进行验证, 发现可以使用这5种基因表达水平的总分, 即 一个综合的mR-NA表达水平评分用于预测某种药物 DILI风险。Oda 等18也应
23、用类似的方法在HepaRG 细胞中进行试验, 发现 IL-1, IL-8和S100A9 共同评 估和预测DILI具有很高的准确性和特异性, 这些基因表达水平的总体评分常在 体外用于筛选DILI药物, 但作为DILI生物标志物还要经过更加系统的评价和验 证, 具体应用到临床还需要一段时间的探索。 1.4 多组学技术的联合应用牛磺胆酸、腐胺、胰岛素样生长因子结合蛋白 1 (insulin-like growth factor-binding protein 1, Igfbp1) 、早期生长反应 蛋白1 (early growth response protein 1, Egr1) 各种组学技术的联
24、合应用为发现生物标志物提供了更全面的分析思路。Buness 等19同时采用代谢组学和基因组学技术, 将8个已知肝毒性化合物给予 Wistar雄性大鼠研究 DILI生物标志物, 其中, 代谢组学发现的牛磺胆酸、腐胺 和基因组学发现Igfbp 和Egr1 的联合应用或许能提高肝毒性早期诊断的准确性 和可信度。Derdak 等20研究发现, Long Evans 大鼠长期给予乙醇后产生的肝 脏脂肪变性和纤维化正是通过 Egr1的活化引起的。 Li等21研究也证明 Igfbp1 基因可以作为检测乙醇引起早期肝损伤的最佳候选标志物。 然而, 这几种生物标 志物的联合应用作为标志物的其他研究较少, 能否在
25、临床前和临床应用还需要 进一步探索。 2 基于DILI 机制研究发现的新型生物标志物 2.1 与炎症反应相关的 DILI 标志物 2.1.1 白细胞介素-17 (interleukin 17, IL-17) IL-17 来源于活化的 T细胞, 可以诱导细胞发生炎症反应。而其在药物诱导炎症 反应引起的肝损伤中起着关键的作用。Furuya 等22通过建立3种 LPS/Gal N 诱导的小鼠肝损伤模型来研究 IL-17A在肝损伤炎症反应中的作用:野生型 组;IL-17A 基因敲除小鼠组;IL-17A敲除+重组的 IL-17A同型二聚体组。给药 24 h后, 发现 IL-17A 敲除组存活率显著高于野
26、生型组, 野生型组中性粒细胞浸润 及细胞凋亡等显著多于 IL-17A 基因敲除组。Yano等23开展了双氯芬酸钠诱导 的小鼠急性肝损伤模型研究, 通过对IL-17 的中和试验, 给药24 h 后用ELISA 方法检测IL-17水平, 发现加入IL-17的抗体组, ALT的水平明显下降, 说明 IL-17 在此肝损伤机制中有一定的作用。Liao 等24研究发现黄芩苷能减弱 IL-17 介导的 APAP 的小鼠肝损伤, 更加证明了 IL-17在肝损伤炎症反应中的作 用。另外, IL-17还参与了肝纤维化、非酒精性脂肪肝等肝脏疾病。IL-17参与 了大多数肝损伤中的炎症反应使其作为生物标志物特异性一
27、般, 在临床前和临 床诊断中只能作为一个辅助的判断。其他的细胞因子如 IL-1, TNF-等也具 有作为潜在DILI标志物的价值。Kakisaka 等25对DILI的临床案例研究发现 细胞因子IL-1, IL-10, IL-12, IL-13和 TNF-的水平在传统酶学生物标志 物水平升高之前就已经升高。IL-1, IL-10, IL-12和IL-13属于细胞因子, TNF- 属于趋化因子, 这些炎症介质一旦被释放就会引起一系列的级联反应, 而过度反应则会引起细胞的损伤。 以上这些细胞因子是否能真正应用到临床还需 要进一步验证。 2.1.2 穿透素-3 (pentraxin-3, PTX-3)
28、 PTX-3 是一种急性反应期蛋白, 在炎症反应中有重要作用。Yaman等26建立了 大鼠APAP 急性肝损伤模型, 并收集肝组织和血浆样本, 测定了血清生化指标, 血浆和组织中PTX-3的水平, 48 h后肝脏坏死, PTX-3水平升高。PTX-3在APAP 诱导的肝坏死中的升高表明其可能是急性肝损伤的生物标志物。 尽管 PTX-3不具 有很好的组织特异性, 但它的确在介导炎症反应中发挥了重要作用, 在临床前 和临床研究阶段可以作为肝损伤评估的一个辅助评估的生物标志物。 2.2 与线粒体损伤机制相关的 DILI 标志物酰基肉碱 (acylcarnitine) 药物引起肝细胞线粒体损伤是导致
29、DILI的一个重要机制。有关线粒体损伤的生 物标志物已经被研究得很多, 酰基肉碱与脂肪酸代谢密切相关, 对长链脂肪酸 在线粒体内进行-氧化起着决定性的作用。当线粒体功能损伤时, 可能会导致 酰基肉碱大量累积。Mc Gill等27发现在 APAP过量诱导的小鼠肝损伤模型中, 酰基肉碱在血清中的浓度明显升高, 并建立了呋塞米肝损伤模型进行对比。 呋塞 米引起的肝损伤并不主要影响线粒体的功能, 结果发现酰基肉碱在呋塞米肝损 伤模型中并没有变化。这说明酰基肉碱对线粒体功能损伤是特异的。 Bhattacharyya等28用儿童作为受试者进行研究, 分为健康组、 APAP 过量组和 APAP治疗剂量组。采
30、用超高效液相色谱-三重四极质谱方法测定和分析各组血清 中酰基肉碱的水平, 结果APAP 过量组酰基肉碱水平显著升高。酰基肉碱或许可 以成为线粒体损伤的 DILI机制的生物标志物, 而它的检测方法目前主要是液质 联用。酰基肉碱对应用到临床前评价和临床诊断中与线粒体损伤相关的 DILI是 有帮助的。 2.3 与氧化应激机制相关的 DILI标志物 2.3.1 还原型谷胱甘肽 (reduced glutathione, GSH) 和氧化型谷胱甘肽 (oxidized glutathione, GSSG) 的比值:GSH/GSSG 氧化应激是在体内自由基过度产生, 如氧自由基等可以破坏体内氧化和抗氧化
31、的平衡, 导致细胞损伤。 氧化应激时细胞内的还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽 是不平衡的。Sentellas 等29通过建立大鼠和人肝细胞体外氧化应激模型, 并 优化了LC-MS/MS的方法, 同时对GSH和GSSG 进行测定, 发现GSH/GSSG 的比值 可以作为一个早期肝毒性筛选的标志物。Zhang 等30在引起氧化应激的疾病研 究中也对GSH/GSSG 的比值作为生物标志物进行了验证。 2.3.2 脂质过氧化产物 脂质过氧化引起的脂肪酸和产物的变化也是 DILI生物标志物研究的一个新思 路。Teppner等31在原代肝细胞中用氟他胺作为肝毒性模型化合物, 并选择了 一组脂质过氧化的产物,
32、 由不同的异前列烷和异前列腺素的衍生物组成, 作为 氧化应激的标志物。结果发现这些脂质过氧化的产物在 DILI的早期检测中比传 统的生物标志物更加敏感。 3 结论与展望 综上所述, 基于快速发展的各种组学技术和肝损伤机制研究的方法进行新型 DILI生物标志物的探索是目前生物标志物研究的一个重要方向, 也取得了较好 的研究成果。例如, 各种组学技术初步发现的标志物都有很大潜力应用到 DILI 临床前研究和临床诊断中, 包括有望与ALT 成为肝损伤检测标准的潜在标志 物:miR-122, FABP-1;特异性不强可以作为辅助诊断的有:HMOX-1, 细胞因子 (IL-17, IL-1, TNF-等
33、) 、PTX-3和基于细胞器损伤机制的标志物;在急性 肝损伤早期检测比 ALT更灵敏的有ASS等, 对胆管增生可能特异的:GCA, TCA; 肝胆管损伤:miR-802;胆汁淤积和脂肪变性药物的筛选标志物:OATP1A1;与ALT 联合应用能提高准确度和不同类型肝损伤的:ARG-1, GSTA, HPD;差异基因表达总 体评分系统作为标志物等。 同时, 多组学技术的联合应用可以同时检测不同表达 水平的生物标志物, 让生物标志物的探索更加全面和高效。 其次, 关于肝损伤新型生物标志物的研究, 应该注意的是: (1) 从多角度、多机 制来作为切入点, 借助各种手段和方法进行发现并验证。 (2) 通
34、过建立不同类 型、不同机制的肝损伤模型来发现一系列特异的新型标志物。 (3) 不能以偏概 全, 亦不可漏掉一个与肝损伤可能相关的标志物。 (4) 大量的临床前实验和临 床验证是必不可少的。 (5) 建立良好和标准的生物标志物检测方法是必要的。 最后, 无论这些新型生物标志物最终能否取代传统的生物标志物, 或者作为对 传统生物标志物的有效补充, 对临床和临床前的 DILI评估都是非常有帮助的。 相信随着科技的不断发展, 组学技术的进一步完善, 临床前早期预测和临床诊 断研究的不断深入, 更多的后续性研究和验证工作的开展, 这些DILI 生物标志 物的应用范围和应用价值将得到更大的体现。 参考文献
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