1、DNA体外重组技术,概述,一、DNA重组技术相关概念,克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。,克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。,DNA克隆(DNAcloning),应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子)-重组DNA 。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆，又称为基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloning)。, “克隆”某一基因
2、或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA (recombinant DNA)。,实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinant DNA technology)，又称基因工程(genetic engineering)。,基因工程目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,二、DNA重组技术基本程序,1.外源DNA（目的DNA）的获取,4.连接物（重组DNA)导入合适受体细胞,3.目的DNA与载体的连接,2.克隆载体的选择与构建,5.重组体的筛选克隆基因的表达,分、切
3、、接、转、筛,供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,基因克隆简介,目的基因 载体 酶切，连接 重组基因 转入 受体细胞 筛选阳性克隆,分,切、接,转,筛,常用工具酶,限制性内切核酸酶： 能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶，简称内切酶。DNA连接酶： 能够在DNA双链5-磷酸基和3-羟基之间形成3,5磷酸二酯键。 封闭DNA的缺口或链接两个DNA片段 T4 DNA 连接酶 来源于噬菌体,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识
4、别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR
5、 I的切割位点,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G ,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C
6、-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0 - 150 mM,DTT,1 mM,0 - 50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,Volume,20 - 100 ml,T T,37 1 - 1.5 hr,酶切效率1 U 核酸内
7、切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全,水解 1 mg 标准DNA所需的酶量,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHI SmaI,5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA
8、5,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,DNA连接酶的基本性质,修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C
9、-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1
10、小时，,完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量,DNA连接酶,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,DNA连接酶,基因载体,载体（vector）：是指能携带目的DNA片段，在宿主细胞内自我复制的DNA分子。,
11、作为基因工程载体所需具备的基本条件：,1. 带有复制子，能在宿主细胞内携带外源基因一同进行复制。,3. 具有多个筛选标志：如抗药基因、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。,2. 有单酶切位点、多克隆酶切位点(多种酶单一位点)，供外源基因的插入。,4. 表达型载体还应有使外源基因表达的完整的转录单位：如强启动子、前导序列、增强子等调控元件。,（一）按功能分类,（二）按受体细胞分类,（三）按载体来源分类,载体的分类,质粒载体：存在于细菌外且能独立复制的双链闭合环状DNA分子克隆用质粒载体表达用质粒载体病毒载体：通过改造病毒基因组DNA，使其具有携带目的基因并且能够在宿主细胞中包装成病毒颗粒的DNA
12、 分子腺病毒载体、慢病毒载体、原核病毒载体（噬菌体）,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA,质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关
13、系,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群,质粒,质粒的基
14、本特征,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,质粒,质粒的基本特征,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合
15、作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定,质粒,质粒的基本特征,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,质粒,质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目
16、前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18 / 19：,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,质粒,重要的大肠杆菌质粒
17、载体,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等
18、,噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工,程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,噬菌体或病毒DNA,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双
19、链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,用于基因转移的受体菌或细胞,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,各种基因工程受体的特性,大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定,适用于外源DNA的扩增和
20、克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,产结构复杂、种类繁多的内毒素,各种基因工程受体的特性,酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,内源性蛋白产物种类繁多且含量高,各种基因工程受体的特性,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，
21、是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,细胞培养条件苛刻，生长缓慢,DNA重组前的准备工作,选择载体的基本原则目的DNA片段大小：质粒容量小、病毒容量大明确重组目的：克隆载体、表达载体合适的克隆位点：酶切，先分析DNA片段酶切位点，再选择合适载体载体的稳定性：有的载体在37时会被宿主菌细胞中的酶降解,磷酸二酯键的形成,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA片段与载体的重组,连接方式： 黏性末端的连接 平头末端的连接 修饰黏性末端的连接 PCR产物的连接 Gateway载体构建体系,一、黏性末端的连接,黏性末端连接(Cohesive end ligation)： 具有黏性末端的两
22、个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。,1.同种酶产生的黏末端的连接,优 点,经济省时，操作方便；外源片段容易回收；,问 题,载体自身环化 插入片段可双向插入,2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点,载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点,无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 Sal片段（CAGCTG） Xho 片段(GAGCTC),G3 CAGCT5,C3 GAGCT5,DNA连接酶,讨论： 连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？,？,二、平末端的连接,平末端连接(blunt end ligation)： 在T4DNA连
23、接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,T4DNA连接酶,AGCT AGCT,TCGA TCGA,优 点,可以用T4连接酶连接任何DNA平端,5-突出粘性末端的补齐 可用Klenow聚合酶补齐3-突出粘性末端的削平 可用T4 DNA聚合酶削平,主 要 问 题,连接效率低高浓度的底物和T4 DNA连接酶添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源DNA片断双向插入,三、修饰黏末端连接,同聚物加尾法： 同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸, 制
24、成人工粘性末端, 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。,优 点,不会发生自身环化作用；连接效率较高；,存在问题,操作繁琐外源片段难回收可能会影响基因表达,衔接物连接法 衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由812个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。,DNA接头法： DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。,人工接头连接,BamHI,BamHI,BamHI,四、PCR产物的连接在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。,在引物上添加酶切位点,！注意添加保护序列Primer1: 5GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC引入的酶切位点是单一的,
