1、流悠病毒的分子进化及跨种间感染机制的研究刘晓玲，孙蕾，刘文军中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，中国科学院微生物研究所分子病毒中心A型流感病毒的天然储存宿主是水禽，它们与水禽共同存在，但不会导致水禽发病，这为流感病毒的长期进化提供了条件。流感病毒的宿主范围非常广泛，会定期地传播到包括哺乳动物在内的其它宿主，并引起暂时感染甚至是死亡或建立持续性感染。因此，按照宿主范围及流行趋势，便产生了人源、猪源、马源以及家禽来源的A型流感病毒。流感病毒在一定范围的物种间传播以及流感病毒的致病性的分子基础还不清楚。1997年以来，当H5N1流感病毒传播到人并引起18位被感染者中的6位死亡之后，又发生了多起禽
2、流感病毒感染哺乳动物的事件。这其中有的是完整的禽源流感病毒直接传播到哺乳动物，有的是禽流感的部分基因片段与哺乳动物来源的流感基因片段重新组合后的病毒在哺乳动物间的传播。此次墨西哥流感的流行毒株便是由猪流感、人流感和禽流感三种流感病毒的基因片段经基因重排而得到的新型变异毒株。我们的研究主要集中于流感病毒的分子进化及跨种间感染机理。1流感病毒的分子进化流感病毒的分子进化研究对于更好地了解流感病毒的遗传变异及其跨种间传播的机理具有重要的意义。目前的研究表明禽流感是人类流感的源头。禽流感能够不断地在家禽和人类中存在和暴发。禽流感病毒也在不断地变异和进化着。流感病毒变异进化的分子基础是抗原漂移和抗原转变
3、。抗原漂移是由编码血凝素蛋白(HA)和或神经氨酸酶蛋白(NA)的基因发生点突变引起的：抗原漂移可引起HA和或NA抗原性发生变化，经常出现：抗原转换是当细胞感染两种不同的流感病毒时，发生片段重排，从而引起突变。流感病毒抗原性变异可能引起致病性更强病毒的出现。猪是流感病毒跨种间传播的中间宿主。20世纪暴发的3次人类大流感都与猪流感密切相关，其流行株都经过猪体内基因重排或突变。此次墨西哥流感的流行毒株的部分基因片段也来源于猪。猪在此变异毒株的形成过程中极有可能发挥了重要的中间宿主的作用。因此，猪流感不容忽视l H3N2亚型流感病毒主要存在于人群和猪群中，自1968年暴发以来这个亚型已经在全世界范围内
4、广泛流行。我们对2007年分离到5株H3N2亚型人流感病毒和4株H3N2亚型猪流感病毒进行了分子进化研究，这9个毒株均于2005年分离自我国广东省。为了确定同一时期同一地区H3N2亚型人流感病毒和猪流感病毒的遗传相关性，将这些毒株的全基因组序列进行了全面分析。5株H3N2亚型人流感病毒的各基因片段均来源于同期的H3N2亚型人流感病毒，而4株H3N2亚型猪流感病毒除个别毒株的个别基因外，均来源于前期的H3N2亚型人流感病毒。猪体中未分离到同期的H3亚型人流感毒株。以上结果表明猪流感病毒比人流感病毒进化要慢一些，这可能是因为猪的生长周期有限，其所受的免疫选择压力远远小于人所受的免疫选择压力，而且人
5、流感病毒在猪体中需要有一个很长的适应过程。另外，4株猪流感病毒中有2株发生了基因重排，表明近年来流感病毒在猪体中的重排现象有所增加。其中l株猪流感病毒的M和NS基因来源于HINI亚型猪流感病毒，HA、NA及其他基因均来源于前期的H3N2亚型人流感病毒。另l株猪流感病毒的PA基因来源于H1NI亚型猪流感病毒，其他基因来源于前期的H3N2亚型人流感病毒。表明人和猪的密切接触将导致流感病毒的跨种间传播并产生新基因型的重组流感毒株，这对于人类健康无疑是一个很大的威胁。2禽流感病毒跨种间传播机理的研究禽H5N1流感病毒在家禽中的流行及其在人群中连续几次的暴发可能会导致下一次流13感的流行。虽然能够感染禽
6、流感病毒的唾液酸受体在人类的上呼吸道中也存在但是其感染机理并不清楚研究禽H5NI流感病毒跨种间传播的分子基础和宿主对流感病毒的限制性其有非常重要的意义。单纯崩受体的特异性来随分禽源和源流感的宿主限制性是小准确的，睬r受体之外的宿土因子也可能在跨种间传播中起着很重要的作用。目前HSNI病毒表现出很高的毒力，然而却不能在人群中有效地传播病毒和宿主的相互作用还有待进一步的研究。对宿主限制性的进步研究也宵助干覆们寻找到冉技的控制禽流感病毒暴发和流行的方法。目前有几种筛选病毒蛋白浦丰蛋白相互作用的方法。主要包括酵母取杂交系统、蛋白组分析、无细胞重建系统城及咀酵母为载体的流感复制系统等。许多宿主圈于被牲现
7、能够与流感庙毒的蚩白相互作用井肚在病毒复制循环的某个过程巾发挥作用(目11。圈1：，流感病击蛋白相q作用的宿主蛋白为了寻找，流感病毒蛋白相瓦作用的宿主田了以便更好地研究禽流感病毒跨种问传播的升子机制。本实验室选择禽流感病毒M1蚩白作为研究的靶点，用酵母职杂交系统筛选与MI相互作用的宿主因子。之所咀选择MI作为研究的靶点，是因为M1是一个多功能蛋白在病毒的复制中起着很重要的作鹏。具体如下：龠流感病毒MI蛋白不仅是流感病毒粒子中含量域丰富的蛋白而且，MI在流感摘毒复制的过程中参与多个步骤。在捕毒感染的早捌M1蛋白从RNP复合物L脱离下米是病毒粒子进入宿主细胞质中所必需的。在病毒复制的后期新合成的M
8、l蛋白再次进入细胞核中与RNP复台物结合并帮助vRNP从细胞核中输Hj。冉成熟的病毒粒于中M1。-j NP蛋白古量的比例影响病毒粒于的形态井且也影响于代病毒粒f的感染性。在细胞质膜的内侧M1-RNP复合物与嵌入细胞质膜的HA、NA、M2柑连接。许多实验表明，MI蚩白与脂质膜相互作用表明MI蛋白在病毒粒子的出芽的过程中起定的作川。当然，最近chert等的研究表明HA、NA的胞质尾区域而不是MI蚩白对十流感病毒的出芽起决定性作用。另外，育体外实验表明，MI蛋白有两个转录抑制区域(T1D)，MI蛋白奉身对于流感病毒的转录肯定的抑制作用。MI表现为膜连接和RNA连接能力，这两个作用都参与病毒的装配。M
9、】通过直接与RNP接触米舟导抑制流感转录酶的活性。Watanake等的研究表明，RNP抑制转录的活性需要MI上9I11I位氮摹酸残基的KNA结合域，这一区域组成了核定位信号(NLS)和MI蚩白的寡聚作用结构域。目前有几种宿土蛋白已经被证明能够与M1相互作刚井参与调控流感病毒的复制过程。热休克连接蛋向70(Hsc70)能够与Ml柑互作用可能通过二者的相互作用帮助vRNp从细胞核中运输到细胞质中。细胞内的caspase8也能结合Ml井参与由流感病毒感染细胞后引起的caspase8介导的细胞凋亡。激活细胞受体的激酶C(RACK1)能与M1相互作用并帮助M1蛋白的磷酸化。另外ERK也能与M1相互作用并
10、帮助M1的磷酸化。细胞核内的组蛋白核心复合物结合MI蛋白可能参与流感病毒在细胞核内的复制过程。本实验室以M1蛋白为靶点，用酵母双杂交的方法筛选与其相互作用的宿主因子，结果筛选到六种与M1相互作用的宿主因子。其中包括CyclophilinA(CypA)。CypA是拥有肽基脯氨酰顺反异构酶活性的多功能蛋白家族的一员，据报道，它参与多种病毒的复制，如HIV一1、VSV、VV以及HCV等。通过蛋白互作的的方法，我们发现CypA能够与M1相互作用，并且在病毒的复制过程中，CypA通过与M1相互作用阻碍Ml蛋白从细胞质输入到细胞核中从而起到抑制病毒复制的作用。进一步的研究还表明CypA在细胞中的表达水平升高会降低细胞的易染性。目前关于流感病毒抑制性因子的报道还不多，CypA作为流感病毒的抑制性因子的发现，为我们进一步认识流感病毒的跨种间感染机理提供了新的思考方向。另外，CypA在细胞中的表达水平升高会降低细胞的易染性。这个现象使我们想到一个新的科学问题：宿主中CypA表达水平是否与不同宿主对流感病毒的易感性的差异有关?目前我们正在做CypA的转基因小鼠，希望从动物水平更进一步地研究CypA在流感病毒过程中的功能。另外，其它几种宿主因子与M1相互作用的研究也正在进行中。宿主因子与病毒蛋白的互作研究将为阐明流感病毒的跨种属传播的机制提供重要的信息。15
