1、 生物化学与分子生物学基本实验实验一 蛋白质的盐析与透析实验目的了解蛋白质的盐析与透析的原理和意义实验原理血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、 球蛋白和 -球蛋白三种。详情见盐析技术。另选择适宜孔径的半透膜，使蛋白质分子被截留，小分子的中性盐透出而达分离的目的。但透析时正负离子透过半透膜的速度不同，如硫酸铵中的 NH4+的透出较快，膜内 SO42-剩余而生成 H2SO4，其酸度足以使蛋白质变性，因此，除盐时开始应对0.14 molL-1 的 NH4OH 透析。本实验分别用双缩脲试剂和 Nessler 试剂检验蛋白质和 NH4+的存在。仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）离心管、试管及
2、试管架。（2）2m1 刻度吸管、玻璃棒、小烧杯。（3）透析袋。 （4）离心机。试剂药品：（1）饱和硫酸铵溶液。（2）硫酸铵粉末。（3）双缩脲试剂 称取 CuSO45H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。另取酒石酸钾钠（NaKC 4H4O6H2O）10g 和 KI 5g，溶于 500ml 蒸馏水中，再加入20氢氧化钠 300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液中，加蒸馏水至 1000ml。此液可长期储存。（4）Nessler 试剂 称取 150g 碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水 100ml 使之溶解，再加入 110g 碘，待完全溶解后加 140g150g 汞，用力振摇 10 分
3、钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。将上清液倾入 2000ml 容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。取贮存液 150ml，加 10氢氧化钠 700ml，混匀后加蒸馏水 150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。本试剂需有适宜的 pH 值，调节至用 1 mol/L 盐酸 20ml 滴定时，需本试剂 11.0ml11.5ml 时为宜。（5）血清样本。实验内容1、取 2m1 血清加入离心管中，再加入 2ml 饱和硫酸铵溶液，
4、用玻璃棒搅匀，静置510 分钟后，用 2000rpm 离心 5 分钟，将上清液移至另一离心管中，分次加入少量硫酸铵粉末，并用玻璃棒搅拌至有少量硫酸铵不再溶解为止，静置 510 分钟后，同上离心，得沉淀和上清液。2、取在蒸馏水中煮沸约 1 小时的 15mm60mm 透析袋一条，一端打结后检查是否漏水，不漏则将水倒掉，加入用 3ml 蒸馏水溶解的第二次沉淀液，挂于盛有蒸馏水的小烧杯中，使袋内外的液面处于同一水平，透析约 30 分钟，每隔 10 分钟更换一次透析液。3、检查 取 6 支试管，按下表操作。表 3-2-1管 号试 剂（滴） 1 2 3 4 5 6袋内液 10 10 透析液 10 10 蒸
5、馏水 10 饱和硫酸铵 10双缩脲试剂 10 10 10Nessler 试剂 10 10 10 混匀后观察并记录结果。思考题1、透析时如何防止蛋白质变性？2、两次沉淀的蛋白质各为何种蛋白质？实验二 凝胶层析法分离蛋自质实验目的1、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和方法。2、了解核酸-蛋白质检测仪和部分收集器的工作原理和使用。实验原理凝胶层析法主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散移动速度各异而使大小不同的分子得到分离的方法。当加在凝胶床表面的混合物随洗脱液进行洗脱时，分子量大的物质阻滞作用小，沿凝胶颗粒的间隙下流，流程短、而移动速度快，先流出层析床，分子量小的物质阻
6、滞作用大，能够进入凝胶颗粒的网孔内，流程长、而移动速度慢，后流出层析床。本实验用葡聚糖凝胶 G-75 分离牛血清清蛋白（分子量 67000）与溶菌酶（分子量 13930）两种蛋白质，用核酸蛋白质检测仪进行检测或用双缩脲反应观察结果。 仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）试管及试管架。（2）层析柱 1.5 cm20cm 的玻璃管柱。（3）大、小烧杯和玻璃棒、吸管、滴管、滤纸。（4）部分收集器和核酸蛋白质检测仪。试剂药品：（1）葡聚糖凝胶 G-75（商品名为 Sephadex G-75） 。（2）洗脱液 称取 Tris 12.12g，KCl 15g，先用少量蒸馏水溶解，再缓缓加入 6.67ml浓 H
7、Cl，定容至 2000ml，此为 0.05 molL-1 Tris-HCl 缓冲液，其 pH 值为 7.5。（3）样品 取牛血清清蛋白和溶菌酶各 50mg ，溶于 1ml 洗脱液中。（4）10NaOH 和 0.5CuSO 4 溶液。实验内容 1、葡聚糖凝胶 G-75 的制备 取适量葡聚糖凝胶 G-75 加入 0.05 molL-1 Tris-HCl 缓冲液中，充分混匀后，置沸水浴中 1 小时或室温下 5 小时，使其充分溶胀，倾除漂浮的细颗粒，再加入少量缓冲液，轻轻搅动后倾除剩余的细颗粒，备用。 2、装柱 将 1.5cm20cm 的玻璃管柱垂直固定于铁架上，下端铺垫棉花或玻璃棉，先用少量洗脱液将
8、气泡赶净，然后将下端活塞关闭，再将凝胶悬液倾入柱中，同时微启活塞，在管中凝胶下沉的同时继续加入凝胶悬液，待沉至约 15cm 高时，加入 2 倍柱体积的洗脱液平衡，然后在柱床表面放一滤纸片，以防加样时凝胶被冲起。 注意：在装柱和层析过程中，不得使液面低于凝胶床表面，否则，空气进入凝胶床中将严重影响分离效果。3、加样 微启下端活塞，使柱上的洗脱液面刚好下降到凝胶床表面时，关紧活塞，用滴管吸取待分离的样品，缓慢地加到凝胶床表面上，微启下端活塞，使样品进入凝胶床，关闭活塞；再按同样方式，反复加入少量洗脱液，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后加入适量的洗脱液，约高出床表面 3cm5cm。4、洗脱 用洗脱液连
9、续洗脱，流速为 25 滴分钟。用 280nm 紫外光监测，用部分收集器从加样开始每 3 分钟收集 1 管洗脱液，至记录仪出现二个峰及基线平稳后，停止洗脱并关机。 5、双缩脲反应观察结果 每个收集管加入 10NaOH 10 滴，0.5CuSO 42 滴，观察并记录结果。 思考题1、洗脱过程中为何要控制流速？2、第一次分离结束后，能否利用原层析柱继续进行分离？为什么？实验三 血清 球蛋白的分离提纯实验目的1、掌握盐析法分离提纯 -球蛋白的原理与方法。2、了解凝胶层析法脱盐的原理和操作。 3、熟悉醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和过程。实验原理分离和纯化蛋白质是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。可利
10、用蛋白质分子量、溶解度和在一定 pH 条件下所带电荷不同等性质的差异，而分离和纯化，盐析法就是常用的方法之一。向蛋白质溶液中加入中性盐（如硫酸铵） ，使溶液的离子强度发生改变，从而使蛋白质表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏而沉淀析出。由于蛋白质的性质不同，故盐析时所需中性盐的饱和度亦异，用下式计算达到所需饱和度时应如入饱和中性盐溶液的体积：V= V 0 (S2 S1) (S1S 2)式中 V 和 V 0 分别代表需加入饱和中性盐溶液的体积和待盐析蛋白质溶液的体积，S 1和 S2 分别代表待盐析蛋白质溶液中该中性盐的原饱和度和所需达到的饱和度。盐析法分离蛋白质多在低温下操作，所得蛋白质沉淀并不变
11、性，但含有大量中性盐分子,可用凝胶层析法脱盐。由于中性盐分子的分子量较小，在凝胶层析过程中的阻滞作用较大，而蛋白质分子的分子量较大,阻滞作用较小，从而达到分离（参见实验凝胶层析法分离蛋白质） 。本实验采用中性盐硫酸铵进行盐析分离血清 球蛋白，用葡聚糖凝胶 G-25 进行脱盐，用双缩脲试剂和 Nessler 试剂分别检验蛋白质和 NH4+，最后用醋酸纤维素薄膜电泳迸行比较鉴定。 仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）离心管、试管及试管架。（2）2ml 刻度吸管、玻璃棒、烧杯。 （3）层析柱：1.1 crn12cm 玻璃管柱及架。（4）滴管、滤纸、反应板。（5）离心机和全套电泳器材。试剂药品：（1）兔
12、血清。（2）PBS（磷酸盐生理盐水缓冲液） 0.2 molL-1，pH7.2 的磷酸缓冲溶液中加入氯化钠至 0.15 molL-1。（3）葡聚糖凝胶 G-25（商品名为 Sephadex G-25） 。（4）pH7.2 饱和硫酸铵溶液 用氨水将饱和硫酸铵溶液调到 pH7.2。（5）Nessler 试剂 称取 150g 碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水 100 ml 使之溶解，再加入 110g 碘，待完全溶解后加 140g150g 汞，用力搌摇 10 分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。将上清液倾入 2000ml 容量瓶中，并用蒸馏水洗涤
13、瓶内的沉淀数次 ,将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度此为贮存液，储于棕色瓶中备用。取贮存液 150ml，加 10氢氧化钠 700ml，混匀后加蒸馏水 150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。本试剂需有适宜的 pH 值，调节至用 1 molL-1 盐酸 20ml 滴定时，需本试剂 11.0ml 11.5ml 时为宜。（6）双缩脲试剂 称取 CuSO45H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。另取酒石酸钾钠（NaKC 4H4O6H2O）10g 和 K15g，溶于 500ml 蒸馏水中，再加20氢氧化钠 300ml，混匀后，慢慢
14、加入硫酸铜溶液申，加蒸馏水至 1000ml。此液可长期储存。 （7）电泳缓冲液、染色液和漂洗液：同蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳定量测定实验。实验内容1、盐析 （1）取 1 支刻度离心管，加入 2.0ml 血清，再加入 2.0ml PBS，混匀后滴加（边加边摇）2.0ml 饱和硫酸铵溶液，混匀后于室温下静置 10 分钟，以 3000rpm 离心 10分钟，弃上清。（2）向沉淀中加入 PBS，使其溶解并加至 1.0ml ，再滴加（边加边摇）0.5ml 饱和硫酸铵溶液，混匀后于室温下静置 10 分钟，同上离心，弃去上清。重复本操作 23 次，沉淀物为初步纯化的 球蛋白。2、脱盐 （1）装柱： 称取 2.
15、5g 葡聚糖凝胶 G-25，倒入 100ml 烧杯中，加蒸馏水50ml，充分混匀后，置沸水浴中 1 小时或室温下 5 小时，使其充分溶胀，静置冷却后倾弃上清液，再加入 PBS10ml，用玻璃棒轻轻搅拌，将 1.1cm12cm 的璃管柱垂直固定于铁架上，下端铺垫棉花或玻璃棉，先用少量洗脱液将气泡赶净，然后将下端活塞关闭，再将溶胀后的葡聚糖凝胶 G-25 悬液倾入柱中，同时微启活塞，在管中凝胶下沉的同时继续加入凝胶悬液，待全部凝胶倾入柱内，且液面接近凝胶面时，关闭下端活塞。为使凝胶面平坦，可用手指轻轻弹动层析柱，然后小心开启下端活塞，以 10 滴min -1 的速度用 2 倍柱体积的洗脱液平衡，当
16、液面恰好与凝胶面重合时，立即关闭活塞，然后在柱床表面放一滤纸片，以防加样时凝胶被冲起。注意：在装柱和层析过程中，不得使液面低于凝胶床表面，否则，空气进入凝胶床中将严重影响分离效果。（2）脱盐 向盛有 球蛋白的离心管内加入 10 滴 PBS 液，并用玻璃棒轻轻搅拌使其全部溶解，再用乳头吸管吸取 球蛋白液，小心地加到凝胶床表面上，使之缓缓滴入，微启下端活塞，使流速为 45 滴min -1，待样品全部缓慢地进入凝胶床，关闭活塞。再按同样方式，反复加入少量 PBS 液，以洗净柱内璧上的样品溶液，然后加入适量的 PBS 液，约高出床表面 3crn5cm，进行连续洗脱。 （3）收集 用 12 支小试管收集
17、洗脱液，每收集 1ml 更换试管，直到 12 支管都收集完，关闭活塞。 （4）检测 准备反应板两块，取每支试管内的洗脱液，分别加在两块反应板的各对应凹内一滴，再向一反应板各凹加双缩脲试剂一滴,向另一反应板各凹加 Nessler 试剂一滴，记录各凹颜色变化，以“”或“”表示不呈色或呈色深浅。3、电泳 将双缩脲反应呈色最深一管中的洗脱液作为样品，与血清作对照，按血清蛋白质醋酸纤维素膜电泳定量测定实验中的操作，进行电泳，呈色后迸行判断。思考题1、盐析过程中各上清和沉淀中主要含何种蛋白质？2、盐析中所达到的硫酸铵饱和度各是多少？3、脱盐过程中，物质洗脱出来的顺序如何？为什么？实验四 酶作用的特异性和影
18、晌酶促反应速度的因素实验目的1、了解酶的催化特异性。2、了解温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。实验原理作为生物催化剂的酶，具有高度的特异性，如唾液淀粉酶只能催化水解 -1，4 葡萄糖苷键，而不能水解 -吡喃葡萄糖-1，2- 呋喃果糖苷键，故只能水解淀粉而不能水解蔗糖。淀粉和蔗糖均无还原性，对班氏试剂呈阴性反应；而它们水解后的产物则为还原糖，与班氏试剂共热时可产生红棕色的氧化亚铜沉淀，据此可检验它们有无水解。酶促反应速度受许多因素的影响，如温度、pH 、激动剂和抑制剂等。上述诸因素对唾液淀粉酶催化淀粉水解反应速度的影响，可用定性或定量反应来观察。利用碘与淀粉及其不同程度水解产物反应
19、的颜色，来衡量酶促反应的速度，即淀粉（蓝色）紫色糊精（紫色）红色糊精（红色）麦芽糖及少量葡萄糖（黄色） ，颜色由蓝变黄，表示酶促反应速度由低到高，此为定性观察；亦可利用夏弗尔一哈德曼试剂测定淀粉水解物中还原糖含量，来定量观察酶促反应的速度。夏弗尔-哈德曼试剂中含有硫酸铜、碘酸钾和草酸钾，在碳酸氢钠和碳酸钠所构成的碱性环境中加热，还原糖可使硫酸铜中的 Cu2+还原成 Cu+；当加入硫酸后，试剂中碘化钾所含的碘离子被碘酸氧化为自由单质碘；而 I2 可将生成 Cu+的氧化成 Cu2+，后者被试剂中的草酸钾络合，从而使上述反应不能逆行，剩余的碘可用标准硫代硫酸钠溶液滴定；按同样方法作空白滴定，所消耗硫
20、代硫酸钠量代表溶液中总碘量。空白滴定时与有还原糖存在滴定时所消耗的硫代硫酸钠之差，代表氧化 Cu2+所消耗 I2 的量，亦即相当于被糖还原生成的 Cu+数量，此 Cu+的量与还原糖的量呈正比，故滴定数据的差数可以定量地代表还原糖的数量。反应如下：Cu2+ Cu +I IO 3 + I 2 2 I Cu 2+草酸钾络合 Na2S2O2I 2NaINa 2S4O6仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）试管及试管架和烧杯。 （2）1ml、2ml、5ml 刻度吸管及滴定管。（3）沸水浴、恒温水浴器。试剂药品：（1）1淀粉溶液和 1蔗糖溶液。（2）1 4 molL -1 氯化钠溶液。 （3）磷酸盐缓冲溶液：
21、pH5.8 、pH6.2 、pH6.6、pH7.0、pH7.4。 （参见附录七）（4）夏弗尔-哈德曼试剂：取结晶硫酸铜 6.5g，溶于 100ml 蒸馏水中，为甲液。取酒石酸钾钠 I2g、无水碳酸钠 20g、碳酸氢钠 25g 溶于 500ml 蒸馏水中，为乙液。取碘化钾10g、碘酸钾 0.8g、草酸钾 18g 溶于（200300）ml 蒸馏水中，为丙液。将乙液加入甲液中混匀后，再将其加入丙液中，混匀后稀释至 1000ml。 （5）14 molL -1 硫酸：取蒸馏水约 250ml，置于 1000ml 容量瓶内，缓缓加入比重 1.84的浓硫酸 28ml，随加随摇，混匀后定容至 1000ml。（6
22、）0.0054 molL-1 硫代硫酸钠溶液：取硫代硫酸钠（Na 2S2O35H2O）约 25g，溶于已沸过的蒸馏水中，稀释至 1000ml。此溶液浓度约为 0.1 4 molL-1，其准确浓度用下述方法标定。用分析天平准确称取碘酸钾（0.150.18）g，溶于 50ml 蒸馏水中，加入 15碘化钾10ml 及 64 molL-1 硫酸 10ml，放置 3 分钟后稀释至 150ml。用以上配制的硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈黄色时，加 1淀粉溶液 5ml 作指示剂，继续滴定至蓝色完全退去，即为终点，记录所用硫代硫酸钠溶液的体积。用 15碘化钾溶液 10ml 作一空白滴定，用此结果校正上述滴定的结果
23、。用下列公式计算所配制硫代硫酸钠溶液的浓度，并将其浓度调整至 0.14 molL-1。硫代硫酸钠的标定浓度（4 molL-1）碘酸钾的克数所用硫代硫酸钠毫升数碘酸钾分子量6000。 用前取凋整好的标准 0.14 molL-1 硫代硫酸钠溶液 50ml，稀释至 1000ml，即为硫代硫酸钠应用液，其浓度为 0.0054 molL-1。（7）碘液：称取碘 1g，碘酸钾 2g，溶于 300ml 蒸馏水中。 实验内容 1、酶作用的特异性 （）稀释唾液：实验者先用水漱口，然后含一口蒸馏水于口中，2 分钟后吐入小烧杯内，用滤纸过滤后，取滤液 1ml 加蒸馏水稀释至 50ml，混匀。（2）取 3 支试管，按
24、下表操作表 3-2-2试 剂 管 号（滴） 1淀粉溶液 10 10 1%蔗糖溶液 10稀释唾液 5（煮沸 10） 5 5混匀后置 38恒温水浴中 30 分钟。（3）取出各管，各加入煮沸的班氏试剂约 2ml，煮沸 2 分钟，放试管架上冷却，观察并己录结果，解释之。2、定量观察温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响（1）稀释唾液：同上。（2）取 12 支试管，按下表操作。表 3-2-3管 号试 剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111% 淀粉溶液 ml 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4氯化钠溶液 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2（CuSO 4）
25、2 ml 缓冲溶液 pH 6.6 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6蒸馏水 ml 3 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5保温 10 分钟 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38稀释唾液 ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5（3）充分混匀后，各管在原温度下继续保温 20 分钟。 （4）在保温期间，另取 12 支试管同样标号，各加入 2ml 夏弗尔- 哈德曼试剂，保温达20 分钟时，立即由各管吸取 2ml 分
26、别加入上述相应号码的试管中，混匀后向各管加入液体石蜡 5 滴置沸水浴中 15 分钟，取出后冷却至室温，此过程均勿摇动。（5）向各管中加入 14 molL-1 硫酸 2ml，轻摇至不产生气泡为止，此时，管内液体应为蓝色。若不呈蓝色，需加入淀粉溶液 23 滴作为指示剂。（6）经 2 分钟后，以 0.0054 molL-1 硫代硫酸钠滴定各管至液体蓝色刚刚消退为止。（7）滴定空白管与滴定各管所消耗硫代硫酸钠溶液之差，即相当于各管的还原糖所还原铜的数量。以此差值为纵坐标，温度和 pH 为横坐标，分别绘制温度和 pH 对酶促反应速度影响的曲线图及激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。3、定性观察温度、pH
27、、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。（1）稀释唾液：同上。（2）取 12 支试管，按下表操作。表 3-2-4管 号试 剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111% 淀粉溶液 ml 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4氯化钠溶液 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2（CuSO 4）2 ml 缓冲溶液 pH 6.6 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6蒸馏水 ml 3 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5保温 10 分钟 38 38 38 38 38 38 38
28、 38 38 38 38 38稀释唾液 ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5（3）充分混匀后，各管在原温度下继续保温 20 分钟。（4）将各管取出，分别滴加碘液 1 滴，混匀后观察比较各管的颜色并记录。思考题1、实验中哪些条件必须准确一致？在实际操作中应注意哪些事项？ 2、影响酶促反应速度的主要因素有哪些？实验五 琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的竞争性抑制作用实验目的了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法和酶的竞争性抑制作用。实验原理琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，而与琥珀酸的化学结构相似的丙二酸，能与琥珀酸竞争酶分子的活性中心，
29、并与之结合，从而抑制酶的活性，升高其 Km 值，抑制程度取决于琥珀酸和丙二酸两者的浓度比。本实验在隔绝空气的条件下，利用甲烯蓝接受氢后退色的程度，来判断肌肉组织中琥珀酸脱氢酶的作用和丙二酸对酶活性的抑制。仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）试管及试管架。 （2）烧杯、乳钵、剪刀、镊子、纱布。 （3）上皿天平、恒温水浴。（4）石英砂、冰块。试剂药品：（1）0.24 molL -1 和 0.024 molL-1 琥珀酸溶液。（2）0.24 molL -1 和 0.024 molL-1 丙二酸溶液。以上四种溶液均先用 0.054 molL-1 氢氧化钠溶液调节至 pH7.0，再用 0.014 molL
30、-1 氢氧化钠溶液调节到 pH7.，然后用蒸馏水稀释到所需浓度。（3）0.14 molL -1pH7.4 磷酸盐缓冲溶液。（4）0.02甲烯蓝溶液。（5）液体石蜡。实验内容1、肌肉提取液的制备 称取新鲜肌肉组织 10g，剪成小碎块，放入烧杯中，用冰冷的生理盐水洗 3 次，再用 0.14 molL-1 pH7.4 的磷酸盐缓冲液洗涤次，弃去液体，移入置于冰块中的乳钵内，加适量的石英砂，研磨成糜状，然后加入 20ml 冰冷的上述缓冲液，混匀后用双层纱布过滤，滤液置冰浴中备用。2、取 5 支试管，按下表操作。表 3-2-5试 剂 管 号（ml） 1 2 3 4 5肌肉提取液 30 30 30 30
31、0.24 molL-1 琉珀酸 10 10 10 100.024 molL-1L 琥珀酸 10 0.24 molL-1 丙二酸 10 10 0.024 molL-1 丙二酸 10 蒸馏水 10 40甲烯蓝 4 4 4 4 43、将各管摇匀，每管滴加（斜执试管，沿管壁缓缓加入）一层液体石蜡于溶液上，以隔绝空气。然后置 37水浴中保温，随时比较记录各管中甲烯蓝的退色情况。思考题 1、为什么实验中要用液体石蜡隔绝空气？ 2、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的活性有何影响？实验六 酮体的生成和氧化实验目的1、了解酮粉法测定酮体的原理和操作。2、验证酮体生成和氧化的部位。实验原理脂肪酸在肝脏中经 氧化生成的乙酰 C
32、oA，经缩合可生成乙酰乙酸，然后进一步还原成 -羟丁酸或脱羧生成丙酮。乙酰乙酸、 羟丁酸和丙酮统称酮体。主要在肝脏产生，被脑和肌肉组织利用。乙酰乙酸及丙酮在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠N a2Fe（NO）（CN） 5反应，生成紫色化合物，该法对乙酰乙酸的反应比对丙酮灵敏 1520 倍。 本实验以辛酸钾为底物，分别与肝组织、肌肉组织和肝与肌肉组织的混合物在一起保温，然后用酮粉法分别测定其酮体。 仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）试管及试管架。（2）手术剪、表面皿、滤纸、滴管。（3）0.5ml、 1ml、 5m1 刻度吸管。（4）恒温水浴器。试剂药品：（1）0.154 molL -1 氯化钠溶液。
33、（2）0.14 molL -1 磷酸盐缓冲溶液： pH7.4。（3）辛酸钾溶液 取 14 molL-1 氢氧化钾溶液 10ml 加入 100ml 容量瓶中，然后再加入幸酸 1.58ml，使其充分混匀，加蒸馏水 50rnl，再加上述缓冲液至刻度，混匀，即为贮备液（0.14 molL -1） 。临用时将此贮备液用上述缓冲液稀释为 0.0024 molL-1。（4）10三氯乙酸溶液。（5）酮粉 称取亚硝基铁氰化钠 1g，无水碳酸钠 20g 和干燥硫酸铵 20g，分别研细后充分混匀，干燥保存。实验内容 1、取 1 只小白鼠，用手术剪断头处死，将血放尽，立即取出肝组织和肌肉组织，分别置于两个表面皿中，用
34、冷的生理盐水反复冲洗，用滤纸吸干后将其剪成碎末备用。2、取 3 支试管，按下表操作。表 3-2-6试 剂 管 号(ml/g) 1 2 3肝组织碎末(g) 0.3 肌肉组织碎末(g) 0.3 混合组织碎末(g) 0.30.002mol/L 辛酸钾溶液(ml) 3.0 3.0 3.0混均后在 37保温 40 分钟,需经常摇动10%三氯乙酸溶液(ml) 1.0 1.0 1.0混匀并静置 10 分钟后，取各管中上清液各 10 滴，分别加入另 3 支内有 10 滴蒸馏水的试管中，混匀后各加入酮粉 0.3g，观察各管颜色并给与解释。注：实验中用于肝和肌肉的手术剪不得混用；若 1 和 3 号管的颜色不能区分
35、时，可再各加少许等量的酮粉。思考题1、为什么实验中的手术剪不能混用？2、为什么实验中需用新鲜组织？实验七 精氨酸酶在尿素生成中的作用实验目的通过本实验来验证肝脏是生成尿素的主要器官。实验原理尿素生成的鸟氨酸循环中的精氨酸酶，能催化精氨酸水解生成尿素和鸟氨酸，尿素在脲酶的催化下可水解生成二氧化碳和氨，用 Nessler 试剂检验 NH4+的存在，即可测定精氨酸酶的活性。反应如下：NH2丨CNH丨 NH2NH NH2 丨 精氨酸酶 丨 （CH 2） 3（CH 2） 3 + H2O C=O + HCNH2HCNH2 NH2 COOHCOOH 精氨酸 尿素 鸟氨酸NH2丨 脲酶CO H2O 2NH3
36、CO2丨NH22NH3 H2SO4 （NH 4） 2SO4仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）扩散皿、0.5ml、1rnl 刻度吸管。（2）乳钵及手术剪、纱布、石英砂。（3）恒温箱。试剂药品：（1）0.01 4 molL -1 硫酸溶液。（2）0.14 molL -1 pH7.4 磷酸盐缓冲溶液。（3）1精氨酸溶液。 （4）饱和碳酸钠溶液。（5）Nessler 试剂：称取 150g 碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水 100ml 使之溶解，再加入 110g 碘，待完全溶解后加（140150）g 汞，用力振摇 10 分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化
37、汞钾为止。将上清液倾入 2000ml 容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。取贮存液 150ml，加 10氢氧化钠 700ml，混匀后加蒸馏水 150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。本试剂需有适宜的 pH 值，凋节至用 14 molL-1 盐酸 20ml 滴定时，需本试剂（11.011.5）m1 时为宜。（6）脲酶溶液：取 30g 刀豆粉（或黄豆粉） ，2g 硒铝酸钠，用 95乙醇 16ml 和84ml 蒸馏水溶解，震荡 10 分钟，过滤，滤液即为脲酶溶液，冰箱中可保存 1
38、015 天。实验内容1、肝匀浆的制备 取 lg 新鲜的肝组织，置于洁净的乳钵中，加适量的石英砂，研磨成糜状，加 0.14 molL-1 pH7.4 磷酸盐缓冲液 50ml，搅拌后用双层纱布过滤，滤液即为含精氨酸酶的肝匀浆。将一部分肝匀浆煮沸后冷却，备用。 2、肌匀浆 取 lg 新鲜的肌肉组织按土法制成匀浆。3、取 3 只扩散皿，按下表操作，勿使内室和外室试剂相混。表 3-2-7试 剂 皿 号（ml） 1 2 3内0.014 molL-1 硫酸溶液 0.5 0.5 0.5 室0.014 molL-1 pH7.4 缓冲液 0.5 0.5 0.5 1精氨酸溶液 0.8 0.8 0.8外 肝匀浆 0.
39、5 煮沸肝匀浆 0.5 0.5 室 肌匀浆 0.5脲酶溶液 0.5 0.5 0.5在外室边缘上涂以凡士林，盖好磨砂盖玻片（磨砂面朝下） ，使其密封，然后将扩散皿在实验台上轻轻地转动数次，使外室中的试剂混匀，置 37温箱中保温 30 分钟后，取出扩散皿，将盖移开一小角，向外室中加入 0.5ml 饱和碳酸钠溶液，立即加盖密封，在实验台上轻轻地转动数次，使之混匀，然后再置 37温箱中保温，20 分钟后取出，各加入0.5mlNessler 试剂于内室中，观察结果。思考题1、为什么扩散皿的内室和外室中的试剂不能相混？2、为什么要在外室边缘上涂以凡士林？ 实验八 维生素 C 的性质及含量测定 实验目的 1
40、、了解维生素 C 的化学性质。2、掌握维生素 C 的测定原理和计算。实验原理维生素 C 又称抗坏血酸，属水溶性维生素，具有较强的还原性，能使 2，6-二氯酚靛酚还原退色。困此利用氧化型 2，6-二氯酚靛酚可测定还原型维生素 C 的含量。氧化型 2，6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。所以当溶从无色转变为红色时，即表示维生素 C 己全部被氧化，此为滴定终点。从 2，6-二氯酚靛酚的消耗量即可计算出维生素 C 的含量。仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）小烧杯。（2）乳钵。 （3）石英砂。（4）纱布。（5）微量滴定管。（6）上皿天平。（7）剪刀及玻璃棒。试剂药品： （1）0.
41、1VitC。（2）2草酸溶液。（3）1 molL -1 碳酸钠溶液。（4）5硫酸铜溶液。 （5）2，6-二氯酚靛酚溶液：称取 2.5g 氧化型 2，6-二氯酚靛酚和 2.1g 碳酸氨钠，溶解于 1000ml 蒸馏水中，充分摇匀后装入棕色瓶内，置冰箱中过夜。临用前过滤，用标准VitC 标定其浓度，置冰箱中可保存一周。（6）VitC 标准溶液：精确称取分析纯 VitC 50mg，置于容量瓶中，用 2草酸溶液溶解并定容至 100ml，此液每毫升含 0.5mg VitC。实验内容1、维生素 C 的化学性质 （1）抗坏血酸氧化酶的制备 用玻璃片刮取黄瓜（或南瓜皮） ，置于乳钵中，加少许石英砂，在冰浴中充
42、分研磨至糜状，再加 2 倍体积的蒸馏水，研磨均匀后用纱布过滤，滤液置冰浴中备用。（2）取 2 个小烧杯，按下表进行操作，依次观察各因素对维生素 C 的影响。表 3-2-8条 件试 剂 酸 碱 加热 加铜加热 酶0.1%VitC 溶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5蒸馏水（ml） 2 2 2 2 22%草酸溶液（ml） 3.5 l molL-1 碳酸钠溶液（滴） 3 5%硫酸铜溶液（滴） 5 抗坏血酸氧化酶液（滴） 10室温下放置 10 分钟，加热条件为 100水浴 10 分钟。2草酸溶液（ml） 3.5 3.5 3.5 3.5混匀后用 2，6-二氯酚靛酚滴定，至出现微红色半分钟
43、不退为止。记录所消耗的 2，6- 二氯酚靛酚的毫升数，取两次滴定的平均值，按下式计算itC 被破坏的百分率：VitC 被破坏的百分率（ V1V2）V 1100 式中 V1 和 V2 分别为酸性条件和其它条件下滴定消耗的 2，6-二氯酚靛酚的毫升数。2、维生素 C 含量的测定 （1）2，6-二氯酚靛酚的标定 取小烧杯两个，各加itC 标准液 1ml，2草酸溶液 lml，用微量滴定管以 2，6-二氯酚靛酚滴定之。小心、缓慢滴定至终点，以微红色半分钟不消失为准，以两次消耗量的平均值，计算 1 ml 2，6- 二氯酚靛酚相当于多少毫克 VitC。（2）样品中 VitC 含量的测定 用上皿天平称取大头菜
44、或白菜 10g，剪碎放入乳钵中，加 2草酸（510）ml，研磨后倒入 50m1 量筒中，用少量 2草酸冲洗乳钵 23 次，一并倒入量筒中，最后用 2草酸加至刻度，混匀，纱布过滤后倒入锥形瓶中，取上清液二份，各为 10ml，用 2，6-二氯酚靛酚滴定至终点，记录结果，求出平均值（v） 。（3）计算：100g 样品中 VitC 的含量（mg ）cv50 1001010c1ml 2，6- 二氯酚靛酚相当于 VitC 的毫克数。 v2，6- 二氯酚靛酚的毫升数。思考题1、VitC 在什么条件下比较稳定？2、此方法测得的 VitC 的含量是否淮确？为什么？实验九 血钙的测定实验目的1、掌握血清钙的测定原理和方法。2、了解测定的临床意义。实验原理血清钙离子在碱性条件下，与钙指
