1、SSR 荧光标记毛细管电泳检测法在水稻DNA 指纹鉴定中的应用672中国水稻科学(ChinJRiceSci),2011,25(6):672676http:/DOI:10.3969/j.issn.10017216.2011.06.016SSR 荧光标记毛细管电泳检测法在水稻 DNA 指纹鉴定中的应用程本义夏俊辉龚俊义杨仕华(中国水稻研究所,浙江杭州 310006;通讯联系人,Email:yangshihua6308163.corn)ApplicationofCapillaryE1ectrophoresisDetectionwithFluorescentSSRMarkersinRiceDNAFin
2、gerprintIdentificationCHENGBenyi,XIAJun-hui,GONGJun-yi,YANGShihua(ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou310006,China;Correspondingauthor,E-mail:ng”308163.corn)CHENGBenyi,XIAJunhui,G0NGJunyi,eta1.Applicationofcapillarye1ectrophoresisdetectionwithfluorescentSSRmarkersinriceDNAfingerprintidentific
3、ation.ChinJRiceSci,2011,25(6):672676.Abstract:With16hybridricemalesterilelines,restorerlinesandcombinationsasmaterials,acapillaryelectroph0resisdetectionmethodwithfluorescentSSRmarkersinricewasprimarilydeveloped.TheaccuratesizeofDNAfragmentcouldbedetectedbythecapillaryelectr0phoresisdetectionmethodw
4、ithfluorescentSSRmarkers.Thecapillaryelectr0phoresisdetectionhastheadvantagesofdataaccuracyandefficiencycomparedwithpolyacrylamidegelelectroDhoresisdetection.ItprovidesafeasibleandreliablemethodforriceDNAfingerprintidentification.Keywords:rice;fluorescentSSRmarker;capillarye1ectrophoresis;DNAfingerp
5、rintidentification程本义,夏俊辉,龚俊义,等.SSR 荧光标记毛细管电泳检测法在水稻品种 DNA 指纹鉴定中的应用.中国水稻科学,2011,25(6):672676.摘要:以 16 个杂交水稻不育系,恢复系及组合为材料,初步建立了水稻品种 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法.与常规凝胶电泳检测方法相比,荧光标记毛细管电泳检测方法可以读出目标 DNA 片段的准确大小,检测数据更为精确,检测效率更高.常规凝胶电泳检测方法验证表明,利用 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法进行水稻品种 DNA 指纹鉴定,方法可行,结果可靠.关键词:水稻;SSR 荧光标记;毛细管电泳;DNA 指纹鉴定
6、中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:10017216(2O11)06067205近年来,以 SSR 标记为基础的 DNA 指纹鉴定技术已趋成熟,并广泛应用于水稻等农作物品种的特异性,一致性,真实性及纯度鉴定.DNA 提取,PCR 扩增和产物分离是DNA 指纹鉴定中的三个关键环节,其中技术难度最大,最复杂的环节是 PCR 扩增产物的分离.目前,在水稻中常用的分离方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法,该方法不能读出目标 DNA 片段的准确大小,检测效率偏低,难以对大规模不同批次品种 DNA 指纹鉴定数据进行有效整合和准确比较.因此,要开展大规模的水稻品种 DNA 指纹鉴定,如全国水稻品种 DN
7、A 指纹数据库的构建,需要建立准确,高效且能直接读出 DNA 片段大小的 SSR 标记检测新方法.对于 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法,前人在小麦,玉米等作物上进行了一些探索,研究结果表明,基于DNA 测序仪的 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法可以得到定量的 DNA 片段分析数据,与常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比,毛细管电泳检测结果更为精确,灵敏,高效,更适用于大批量品种的检测分析.本研究以 16 个杂交水稻不育系,恢复系及组合为材料,建立了基于 ABI3130XLDNA 测序仪的水稻品种 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法,可为今后开展大规模的水稻品种 DNA 指纹鉴定及数据库构
8、建提供技术支撑.23A;恢复系 4 个,分别是岳恢 9113,扬稻 6 号,籼恢 207 和蜀恢 527;杂交水稻组合 8 个,分别是扬两优 6 号(广占 634s扬稻 6 号),岳优 9113(岳 4A岳恢 9113),金优 207(金 23A籼恢 207),1I 优 838(II 一 32A辐恢 838),D 优 527(D62A蜀恢 527),中优 117(中 9A常恢 117),丰两优 1 号(广占63S9311)和中浙优 1 号(中浙 A航恢 570).1.2SSR 标记根据前期研究结果,选取 4 个多态性较高的 SSR 标记(RM5414,RM258,RM311 和 RM336).
9、这些标记的荧光引物序列由美国 ABI 公司合成,在正向引物上加注的荧光染料分别是 PET(红),NED(黄),FAM(蓝)和 VIC(绿).普通引物序列由上海生工生物工程有限公司合成.1.3DNA 提取和 PCR 扩增水稻种子在 30恒温下发芽 57d 后,每个材料随机取 2O 株幼苗,采用简易法混合提取总 DNA,溶解于 200“L0.1TE 中,储于一 2OC 冰箱中备用.PCR 总体积为 1OL,包含 1.0L 模板 DNA,1.5mmol/LMg,0.2mmol/LdNTPs,正反向引物各 0.5mol/L,5SSR 缓冲液 2.0I 和 TaqDNA 聚合酶 0.5U.反应在东胜龙
10、EDC 一 810 型基因扩增仪上进行,步骤如下:材料与方法霎昙茎 2 国 0 家 11-科 04 技-0 妻项 E目:2.011BA08.0.6B0;中央级1.1 实验材料公益性科研院所专项资金资助项目(2009RG0053);农业部农产品杂交水稻不育系 4 个,分别是 1I 一 32A,中 9A,内 2A 和金质量安全监管(种子管理) 项目.程本义等:SSR 荧光标记毛细管电泳检测法在水稻品种 DNA 指纹鉴定中的应用94下预变性 2rain;94下变性 45S,55下退火 45S,72下延伸 1rain,30 个循环;最后 72延伸 10rain.1.4SSR 荧光标记毛细管电泳检测1.
11、4.1 稀释为确定 PCR 产物的最佳进样浓度,对 4 个荧光标记的PCR 产物设计了稀释 1O,2O,3O 倍 3 种浓度的梯度实验.结果表明,各标记的最佳稀释倍数不尽相同,RM5414,RM258,RM311 和 RM336 的最佳稀释倍数分别是 2O,3O,1O 和 30倍.由此可见,要获得比较理想的检测效果,应先用超纯水对荧光标记的 PCR 产物进行稀释,具体稀释倍数因标记而异,原则上是 PCR 扩增效率越高的标记需要稀释的倍数越高.1.4.2 纯化毛细管电泳对 DNA 样品的纯度要求高,进样前需对稀释后的 PCR 产物进行纯化,去除其中的蛋白质等杂质.具体方法如下:吸取稀释后的 PC
12、R 产物 1”L 注入进样板 ,加超纯水 9I 使总体积至 1OL,简单离心.再加入 3OL 乙醇乙酸钠,盖好密封膜,置于 8,3600r/rain 下离心 3Orain.倒掉上清液,加入 5OL70 乙醇漂洗 1 次 ,置于工作台上晾干.1.4.3 变性在含有待检样品的进样板的每个样品孔中加入 8L 去离子甲酰胺和 0.05td 内标 GeneScan500LIZ 的混合液,置于离心机中 1000r/min 下离心 1rain.然后将装有样品的进样板放入东胜龙 EDC-810 型基因扩增仪中 95.C 下变性 5min,取出后置于 4C 冰箱中冷却 10rain.1.4.4 电泳将含有待检样
13、品的进样板置于离心机中 1000r/min 下离心 1rain,然后放入 ABI3130XLDNA 测序仪中开始毛细管电泳:预电泳 15kV 下 3rain;电进样 1.6kV 下 23S;正式毛细管电泳 15kV 下 20min.同时,用 DataCollection 软件收集原始数据.1.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测每份样品吸取 2L 的 PCR 扩增产物和加样缓冲液的混合液,上样于 6 的非变性聚丙烯酰胺凝胶,估计目标片段大小,在 120V 电压条件下电泳 35h.电泳完成后银染显色,沥干后扫描成像.1.6 指纹记录对于 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法,用 GeneMapper
14、软件对 DataCollection 软件收集的原始数据进行分析.软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标 GeneScan500LIZ 进行比较,直接给出目标 DNA 片段的准确大小,进行适当数据处理后得到待检样品的指纹.对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,首先各标记检测到的多态性片段依据分子量从大到小按 1,2,3,进行编号,然后根据目标DNA 片段在凝胶上的迁移位置,以 1 和 0 分别代表检测到和未检测到相应多态性片段(等位基因)的方式记录待检样品的指纹.2 结果与分析2.1 准确性与重演性为了确保数据的准确性,GeneMapper 软件在原始数据673分析时会对每一根毛细管泳道的电
15、泳过程进行质量评估,计算出若干个参数.其中最重要的参数是 sQ 值,该值的高低直接反映了内标 GeneScan500LIZ 和待检样品的电泳过程是否正常及峰值是否准确.若 sQ 值( 范围 O1) 大于 0.75,则表明该毛细管泳道电泳正常,检测数据准确;若 SQ 值小于0.75,则表明该毛细管泳道需要进行校正分析或重新电泳.因此,SSR 荧光标记毛细管电泳检测数据准确的前提是 sQ值大于 0.75.常规的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法不能读出目标 DNA 片段的准确大小,只能依据目标条带在凝胶上的迁移位置,与标准 DNA 分子量 Marker 比较,估测出目标DNA 片段的大小.而荧光标记
16、毛细管电泳检测,GeneMapper 软件系统会依据待检测材料目标峰的位置,与同一毛细管泳道的内标 GeneScanS00LIZ 比较,读出目标 DNA 片段的准确大小.如图 1 所示,一 32A 在 RM336 座位上表现为纯合体,记录一条目标 DNA 片段,依据最高峰的位置,目标片段大小是 154.62bp;扬两优 6 号在该座位上表现为杂合体,记录两条目标 DNA 片段,依据最高峰的位置,目标片段大小分别是 154.62bp 和 192.20bp.可见,相比于常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,SSR 荧光标记毛细管电泳检测可以读出目标 DNA 片段的准确大小,检测数据更为精确.表 1 显示,
17、在荧光标记 RM336 座位上,16 个实验材料的目标片段 1 和片段 2 的 3 次重复毛细管电泳检测数据的极差分别是 0.000.15bp 和 0.000.06bp,均远小于 1bp的可接受检测误差.表明在 sQ 值均大于 0.75 的情况下,SSR 荧光标记毛细管电泳检测数据的重演性高.2.2 可行性与可靠性各荧光标记座位上独立进行 3 次重复的毛细管电泳检测,取 3 次重复的平均值并四舍五入取整,作为实验材料在该座位上的指纹数据.据此,本研究鉴定获得了 16 个实验材料在 4 个荧光标记座位上的定量 DNA 指纹数据( 表 2).统计分析发现,基于 16 个实验材料,4 个 SSR 荧
18、光标记共检测到 17 个等位基因.其 electrophoresisprofilesoflI 一 32AandYangliangyou6atfluorescentmarkerlocusRM336.咖咖弓咖栅 0 啪伽|弓 0扫 8 董.u 鑫譬 p8nI 慧674 中国水稻科学(ChinJRiceSci)第 25 卷第 6 期(2011 年 11 月)表 116 个实验材料在荧光标记 RM336 座位上的 3 次重复检测片段数据Table1.Fragmentsizesof16ricematerialsatfluorescentmarkerlocusRM336withthreerepetitio
19、ns.bp154.62154.53l38.65l54.58154.58151.54154.58154.53154.62154.59154.58154.53154.58154.58151.53192.16154.67154.58138.65154.63154.63151.53154.54154.48154.63154.67154.63154.58154.54154.6315l_52l92.10192.14192.14154.62154.58138.65154.54154.63151.45154.63154.63154.58192.16154.63154.63154.54192.2O154.631
20、54.54l51.60192.14192.140.050.050.000.090.050.090.090.150.050.080.050.050.090.090.080.060.060.00116 分别是实验材料32A,中 9A,内 2A,金 23A,岳恢 9113,扬稻 6号,籼恢 207,蜀恢 527,扬两优 6 号,岳优 9113,金优 207,fl 优838,D 优 527,中优 117,丰两优 1 号和中浙优 1 号.下同.116refertO1I 一32A,Zhong9A,Nei2A,Jin23A,Yuehui9113,Yangdao6,Xianhui207,Shuhui527,Y
21、angliangyou6,Yueyou9113,Jinyou207,IIYou838,Dyou527,Zhongyou117,Fengliangyou1andZhongzheyou1,respectively.Thesameasintablesandfiguresbelow.检测到 5 个等位基因,片段大小分别是 170,180,182,184 和186bp;RM336 检测到 4 个等位基因,片段大小分别是 139,152,155 和 192bp.为了检验荧光标记毛细管电泳检测方法的可靠性,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法对 16 个实验材料在 4 个 SSR 荧光标记座位上的毛细管电泳检测指纹
22、数据进行了验证.表 2显示,在所有 4 个 SSR 标记座位上,两种方法检测到的等位基因数目和各实验材料对应的等位基因类型均一致.如在RM336 标记座位上 ,6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到4 个等位基因,即图 2 中从上到下箭头所指的 4 条谱带,与荧光标记毛细管电泳检测到的大小分别为 192,155,152 和 139bp 的多态性片段一一对应;此外,16 个实验材料的凝胶电泳带型表现与毛细管电泳的峰型表现一致.上述结果表明,利用 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法进行水稻品种 DNA 指纹鉴定,方法可行,结果可靠.2.3 多重毛细管电泳检测所谓多重毛细管电泳是指在一根毛细管泳道中同时
23、对 2对或 2 对以上 SSR 荧光引物的 PCR 扩增产物进行电泳检测.将 RM258 和 RM336 两重与一重荧光标记毛细管电泳检测的片段数据进行成对比较,发现在荧光标记 RM258 座位上,目标片段两重与一重的差值的绝对值小于 0.13bp;在荧光标记 RM336 座位上 ,目标片段两重与一重的差值的绝对值小于 0.22bp,均小于 1bp 的可接受检测误差(表 3).在三重(RM258+RM336+RM311)毛细管电泳检测尝试中也得到了类似的结果(图 3).一重电泳时,RM258,RM336,RM311 这 3 个座位上的目标片段大小分别是 137.43,l54.58,l69.87
24、bp;三重电泳时,3 个座位上的目标片段大小分别是 137.4o,154.58 和 169.82bp.但同时发现,随着毛细管电泳重数的增加,sQ 值的通过率(SQ 值大于 0.75 的比率)下降 .可见,多重毛细管电泳检测方法可行,但尚需进一步优化实验条件,且电泳重数要适当,并非越多越好.2.4 检测效率通常情况下,采用常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法,每人每天至多检测 400 个 PCR 样品.基于 ABI313OXLDNA 测序仪,在一重荧光标记毛细管电泳的情况下,一次可同时检测 16 个 PCR 样品,耗时约 0.5h,每人每天可检测768 个 PCR 样品.若实现两重荧光标记毛细管电泳
25、,则每人每天可检测 1536 个 PCR 样品.若实现四重荧光标记毛细管电泳,则每人每天可检测 3072 个 PCR 样品.可见,荧光标记毛细管电泳检测效率明显高于常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法.但荧光标记毛细管电泳检测所需的 DNA 测序bD300图 2i6 个实验材料在 RM336 标记座位上的带型表现Fig.2.Allelesof16ricematerialsatmarkerlocusRM336加222046789nH程本义等:SSR 荧光标记毛细管电泳检测法在水稻品种 DNA 指纹鉴定中的应用表 2l6 个实验材料在 4 个 SSR 标记座位上的毛细管与凝胶电泳检测指纹数据Table
26、2.DNAfingerprintsof16ricematerialsbycapillaryandgelelectrophoresisdetectionsatfourSSRmarkerloci.675方法,标记与等位基因 12345Method,markerandallele11毛细管电泳 CapillaryelectrophoresisRM54l4片段 1Fragment111O11211Ol1211811O112118110片段 2Fragment2RM258片段 1Fragment1137137137137129137133146133片段 2Fragment2137RM311片段 1Fr
27、agment117O17018217018218O170184180片段 2Fragment2186RM336片段 1Fragmentl155155139155155152155155155片段 2Fragment2192聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamidegelelectr0phoresisRM5414100002010131010RM2581RM311l4RM33614O01110O110112110112112110110118118118118129133129133137133129137137l46146137139170170170170170180123Aatflu
28、orescentmarkerlociRM258,RM336andRM311.仪及配套试剂价格昂贵,一般实验室可能难以承受.3 讨论在采用 SSR 标记聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法构建水稻品种 DNA 指纹数据库的工作中,如何准确地整合不同批次,不同胶块的水稻品种 DNA 指纹鉴定数据一直是个难题.在构建南方水稻区试品种 DNA 指纹数据库工作中,我们采取了每块胶上设置标准带型对照(所有已知的多态性DNA 片段), 所有待检品种的等位基因类型通过与标准带型对照比较确定的办法加以解决.多年的应用实践证明结果基本上是准确可靠的,但当待检品种在凝胶泳道上的位置与标准带型对照较远,且标准带型对照上相邻等位
29、基因片段差异较小时,待检品种的等位基因类型难以确定,对指纹数据的准确性有一定的影响.而 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法,依据待检品种目标峰的位置,与同一毛细管泳道的内标 GeneScan500LIZ 比较,直接读出目标 DNA 片段的准确大小,无需设置标准带型对照.显然,与常规的凝胶电泳检测方法相比,荧光标记毛细管电泳检测数据更为精确,同时OO0O1OO1O0OOlOOO01OO0O1OO676 中国水稻科学(ChinJRiceSci)第 25 卷第 6 期(2011 年 11 月)表 316 个实验材料在 RM258 和 RM336 荧光标记座位上一重与两重电泳检测的片段大小Table3
30、.Fragmentsizesbysingleanddiplexcapillaryelectrophoresisdetectionof16materialsatfluorescentmarkerlociRM258andRM336.bp很好地解决了大规模不同批次 DNA 指纹鉴定数据有效整合和准确比较的问题.本研究对 l6 个实验材料在 4 个荧光标记座位上的毛细管电泳检测指纹数据进行了 6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法验证,结果显示,两种方法检测到的等位基因数目和各实验材料对应的等位基因类型均一致.这不仅表明了利用 SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法进行水稻品种 DNA指纹鉴定的可行性和可靠
31、性,同时也表明了两种方法鉴定的DNA 指纹数据进行有效转换和整合的可能性.转换的总体思路是,对各标记所有已知的等位基因片段进行荧光毛细管电泳检测,测得各多态性 DNA 片段的准确大小,然后将/o模式的 DNA 指纹数据转换成对应的定量 DNA 指纹数据.由此,可实现常规凝胶检测方法构建的 1/0 模式 DNA 指纹数据的升级和已有数据的充分利用,加快水稻品种 DNA 指纹库的构建进程.多重毛细管电泳不仅可以成倍提高检测效率,而且还可以显着降低检测成本.但本研究发现,随着毛细管电泳重数的增加,sQ 值通过率下降 .究其原因,可能是不同引物的PCR 扩增产物叠加并相互干扰,或是进样 PCR 扩增产
32、物浓度等实验条件不佳,使得内标 GeneScan500LIZ 及 PCR 扩增产物毛细管电泳不正常,峰值出现偏差.因此,有必要调整优化部分 SSR 标记,使其满足荧光标记检测及多重毛细管电泳的要求.同时,进一步调整优化荧光标记毛细管电泳的实验条件,不断提高 sQ 值通过率,最终建立一套完善的基于SSR 荧光标记毛细管电泳方法的水稻品种 DNA 指纹检测技术体系.参考文献:2程本义,施勇烽,沈伟峰,等.南方稻区国家水稻区域试验品种的微卫星标记分析.中国水稻科学,2007,21(1):7-12.程本义,施勇烽,沈伟峰,等.水稻品种 DNA 指纹检测技术体系及其应用.杂交水稻,2008,23(1):
33、54 59.3程本义,吴伟,夏俊辉,等.浙江省水稻品种 DNA 指纹数据库的初步构建及其应用.浙江农业,2009,21(6):555560.4朱玉君,毛一剑,庄杰云,等.利用 SSR 标记鉴定杂交水稻种子纯度.中国稻米,2009,16(6):24 26.5HuangXQ,BOrnerA,ROderMS,eta1.Assessinggeneticdiversityofwheat(TriticumaestivumL.)germplasmusingmicrosatellitemarkers.TheoT”AplGenet,2002,105:699707.6王凤格,赵久然,郭景伦,等.中国玉米新品种 D
34、NA 指纹库建立系列研究:I.玉米品种纯度及真伪鉴定中 SSR 技术标准实验体系的建立.玉米科学,2003,11(1):3-6.7李俊芳,张雪原,孙世贤,等.国家玉米主产区预试品种的SSR 分析:I.预试品种的真实性和一致性评价.玉米科学,2006,14(6):3842.8张雪原,赵攀峰,王凤格,等.玉米品种 SSR 分子标记与田间小区种植一致性鉴定结果的比较.玉米科学,2009,17(1):4O 一 45.9王立新,李云伏,常利芳,等.建立小麦品种 DNA 指纹方法的研究.作物,2007,33(10):17381740.1o郝晨阳,王兰芬,贾继增,等.SSR 荧光标记和银染技术的比较分析.作
35、物,2005,31(2):144 149.11易红梅,王凤格,赵久然,等.玉米品种 SSR 标记毛细管电泳荧光检测法与变性 PAGE 银染检测法的比较研究 .华北农学报,2006,21(5):6467.12刘晓鑫,谢传晓,赵琦,等.基于 SSR 荧光标记技术的玉米群体混合样本基因频率分析方法.中国农业科学,2008,4l(12):3991-3998.13龚亚明,胡齐赞,毛伟华,等.ESTSSR 荧光标记毛细管电泳检测法在豌豆上的应用及评价.浙江农业,2009,21(6):54O 一 543.14ZhengKL,HuangN,BennettJ,eta1.PCRbasedmarkerassistedselectioninricebreeding/IRRIDiscussionPaperSeriesNo.12.Manila:IRRI,1995.
