1、鼠抗人 cTnI 单克隆抗体 Fab 段基因克隆和序列分析公文易文秘资源网 佚名 2008-10-14 0:33:41 我要投稿 添加到百度搜藏提取的 RNA 纯度很高. H1,H4,H5,H7 上游引物与下游引物 IgG1 扩增出 800 bp 左右片段；H3 扩增出 400 bp 左右片段； H2,H6 未见片段扩出（图 1）. 下游引物 IgG2b，IgG3 与所有上游引物配对均未见片段扩出. 测序报告证实 H1，H4 ， H5，H7 引物扩增的重链 Fd 段基因具有同源性. 图 2, 3 为轻链 PCR 扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明 L13 引物扩增出 700 bp 左右
2、片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.M：DL2000 marker;1717 对上游引物扩增的重链 PCR 产物.图 1 重链 Fd 琼脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;1515 对上游引物扩增的重链 PCR 产物.图 2 15 对上游引物扩增的轻链 PCR 产物电泳（略）2.2 转化感受态细菌 选取 H1 和 L13 的 PCR 产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为 11，白色菌落均有 20 余个，对重链、轻链分别挑取 16 个菌落.23 菌落 PCR 电泳 可见重链 800 bp 左右的片段，可见轻链 700 bp 左右
3、的片段（图4，5），证明有目的片段插入 T 载体中. 用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至 TaKaRa 公司测序.2.4 重组质粒的插入片段测序报告7-9 GenBank 登录号分别为 AY484430，AY484431.轻链第 23 位和第 93 位亦为骨架区的两个半胱氨酸（Cys）. 上述获得的抗体 Fab 段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人 cTnI 单抗基因, 为 IgG1 亚型. 网上核对 V BASE 数据库，重链可变区属于 VH3 家族，J 段来源于 JH3a，轻链可变区属于 VK亚类（Subgroup），J 段来源于 JK2.M：DL2000 marker；18613 对
4、上游引物扩增的轻链 PCR 产物.图 3 613 对上游引物扩增的轻链 PCR 产物电泳（略）M：DL2000 marker;1，6，8，9：未插入重链 Fd 段的 PCR 产物；25，7：插入重链 Fd 段的 PCR 产物.图 4 重链片段的菌落 PCR 琼脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;14，613，15，16：插入轻链片段的 PCR 产物；5，14：未插入轻链片段的 PCR 产物.图 5 轻链片段的菌落 PCR 琼脂糖凝胶电泳（略）3 讨论由于本实验室已有能分泌 mAb cTnI 的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用 RTPCR 技术，将抗 cTnI 抗
5、体的 Fab 段基因扩增出来，测序，经 Internet 网(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)7核实，发现 H1，H5，H7 3 种引物扩增出来的重链序列具有同源性，为同一序列；在轻链基因克隆中，获得一个无功能的轻链产物，它来自杂交瘤亲代细胞之一骨髓瘤细胞 SP2/0. 有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道，最突出的特点是其轻链基因的第 23 位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸（Cys）. 如 L25，L610 等上游引物扩增出来的 cDNA 片段，均为这种无功能的轻链产物. L1，L11, L12 等上游引物扩增出来的 c
6、DNA 片段测序，经核实证明，缺失 FR1 和 CDR1 功能区. 唯有 L13 上游引物扩增出来的 700 bp 的 cDNA 片段为有功能的轻链基因产物. 为得到完整的 Fab 段基因序列，取 H1 和 L13 引物 PCR 产物做TA 克隆. 测序结果用 BLAST 和 DNAman 软件分析，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码. 目前国内外尚未见抗 cTnI 抗体基因序列相关报道 . 在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为 AY484430，AY484431. 抗人 cTnI 抗体的 Fab 段基因的克隆及序列分析为抗
7、人 cTnI 嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】1 张寄南，杨国平，苏恩本, 等.血清肌钙蛋白 I 诊断急性心肌梗塞的研究J，中华心血管病杂志，1997, 25(5), 379-382.2 张寄南，苏恩本，魏 瑾, 等.血清肌钙蛋白 I 升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨J，中华心血管病杂志，1999, 27(6), 421-424.3 Nageh T, Sherwood RA, Harris BM, et al. Cardiac troponin I for risk stratification following percutaneous coronary artery in
8、tervention in acute coronary syndromesJ. Catheter Cardiovasc Interv, 2001, 55(1), 37-42.4 mith SC Jr, Blair SN, Bonow RO, et al. AHA/ACC Guidelines for Preventing Heart Attack and Death in Patients With Atherosclerotic Cardiovascular DiseaseAK GTG CAG CTC GAG SAG TCA GGA CCT3； H2: 5GAG GTY CAG CTC G
9、AA CAR TCT GGA CCT3；H3: 5CAG GTC CAA CTC GAG CAG YCT GGG KCT3；H4: 5GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGR GCWG3；H5: 5GAR GTG AAG CTC GAA GAG WCT GGA SGA3 ；H6: 5GAG GTG AAG CTT CTC GAC TCT GGA GGT3；H7: 5GAA GTG MAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA3；轻链基因的 5端引物 1：5 CCT CTA GAG ACA TCC AGA TGA MCC AGT CTC C3；2：5CCT CTA
10、 GAG ACA TYK TGC TGA CYC ART CTC C3；3：5CCT CTA GAR ACA TTG TRA TGA CMC ART CTC C3；4：5CCT CTA GAG ACA TYC AGM TGA CYC AGT CTC C3；5：5CCT CTA GAG GAG ACA TTG TGA TGA CCC AGT C3；6：5CCT CTA GAG ATA TTG TGM TAA CYC AGK MTS MAS YC3 ；7 ：5CCT CTA GAG ATA TCS WKA TGA CMC AGW CTM C3；8：5CCT CTA GAG CTG TTG TGR
11、TGA CYC AAA CTC C3；9：5CCT CTA GAG ATG TTK TGA TGA CCC AMA CTC C3；10：5CCT CTA GAG ATG TTT TGA TGA MCC AAA YTC C3；11：5CCT CTA GAG ARA ATS TGC TCA CCC AGT CTC C3；12：5CCT CTA GAS AAA TTG TTC TCA CCC AGT CTC C3 ；13：5CCT CTA GAC AGG CTG TTG TGA CTC AGG AAT C3;重链 Fd 段 3端引物 IgG1：5 AGG CTT ACT AGT ACA ATC CC
12、T GGG CAC AAT3;IgG2b：5CTC CTTACTAGTAGGACAGGGGTTGATTGT3;IgG3：5GGG GGT ACT AGT CTT GGG TAT TCT AGG CTC3;轻链基因 3端引物： 5GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA3. 以上 S=C/G，Y=C/T，M=A/C，W=A/T，K=T/G，r=A/G，由 TaKaRa 公司合成.122 细胞总 RNA 提取 从生长良好、能分泌 mAb cTnI 的杂交瘤细胞中，用异硫氰酸胍法从 5107 杂交瘤细胞中提取总 RNA.123 RTPCR 扩增及其产物
13、克隆 以 Oligo dT9 为引物逆转录合成 cDNA. 以合成的 cDNA 为模板，用上述上下游引物分别两两配对，进行 PCR，扩增出 Fab 段的重、轻链基因片段. 重链 Fd 段 PCR 反应条件为：94变性 45 s，57退火 45 s，72延伸 60 s，35 个循环，最后 72延伸 5 min；轻链反应条件为：94 预变性 10 min, 94变性 1 min，60退火 1 min，72延伸 1 min，35 个循环，最后 72延伸 10 min. 回收扩增的 Fd和轻链基因，分别插入 pMD18T 载体中，取 T 载体 0.5 L，回收的 Fd 或轻链基因 4.5 L，Liga
14、tion Solution 15 L，总反应体积 10 L，16 过夜反应. 取 4 L 连接反应液转化 E.coli DH5 菌6. 利用蓝、白斑筛选，菌落 PCR 鉴定重组质粒.124 菌落 PCR 鉴定目的基因片段插入 引物序列为 T 载体的测序引物：上游引物（Sequencing Primer RVM）：5GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG3，下游引物（Sequencing Primer M1347）：5 CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC3，PCR 反应条件为： 94预变性 10 min，94变性 1 min, 52退火 2 min，72
15、延伸2 min，30 个循环，最后 72延伸 10 min. 取 10 L 的反应体积以 13 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物. 电泳照片经 计算机图像分析软件 Quantity One 处理.125 DNA 序列测定与分析 将 DNA 样品及抽提的重组质粒送大连宝生物制品有限公司，经 AB1310 全自动测序仪进行序列测定. 用 DNAMAN 和 BLAST 软件分析所测序列.2 结果21 RNA 提取和 RTPCR 扩增的目的基因片段及测序 从分泌 mAb cTnI 抗体的杂交瘤细胞系 JS200202 中提取总 RNA，紫外分光光度计 A260 nm/A280 nm1.9, 说
16、明提取的 RNA 纯度很高. H1,H4,H5,H7 上游引物与下游引物 IgG1 扩增出 800 bp 左右片段；H3 扩增出 400 bp 左右片段； H2,H6 未见片段扩出（图 1）. 下游引物 IgG2b，IgG3 与所有上游引物配对均未见片段扩出. 测序报告证实 H1，H4 ， H5，H7 引物扩增的重链 Fd 段基因具有同源性. 图 2, 3 为轻链 PCR 扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明 L13 引物扩增出 700 bp 左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.M：DL2000 marker;1717 对上游引物扩增的重链 PCR 产物.图 1 重链 Fd 琼
17、脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;1515 对上游引物扩增的重链 PCR 产物.图 2 15 对上游引物扩增的轻链 PCR 产物电泳（略）2.2 转化感受态细菌 选取 H1 和 L13 的 PCR 产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为 11，白色菌落均有 20 余个，对重链、轻链分别挑取 16 个菌落.23 菌落 PCR 电泳 可见重链 800 bp 左右的片段，可见轻链 700 bp 左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入 T 载体中. 用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至 TaKaRa 公司测序.2.4 重组质粒的插入
18、片段测序报告7-9 GenBank 登录号分别为 AY484430，AY484431.轻链第 23 位和第 93 位亦为骨架区的两个半胱氨酸（Cys）. 上述获得的抗体 Fab 段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人 cTnI 单抗基因, 为 IgG1 亚型. 网上核对 V BASE 数据库，重链可变区属于 VH3 家族，J 段来源于 JH3a，轻链可变区属于 VK亚类（Subgroup），J 段来源于 JK2.M：DL2000 marker；18613 对上游引物扩增的轻链 PCR 产物.图 3 613 对上游引物扩增的轻链 PCR 产物电泳（略）M：DL2000 marker;1，6，8，9：
19、未插入重链 Fd 段的 PCR 产物；25，7：插入重链 Fd 段的 PCR 产物.图 4 重链片段的菌落 PCR 琼脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;14，613，15，16：插入轻链片段的 PCR 产物；5，14：未插入轻链片段的 PCR 产物.图 5 轻链片段的菌落 PCR 琼脂糖凝胶电泳（略）3 讨论由于本实验室已有能分泌 mAb cTnI 的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用 RTPCR 技术，将抗 cTnI 抗体的 Fab 段基因扩增出来，测序，经 Internet 网(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)7核实，发现 H
20、1，H5，H7 3 种引物扩增出来的重链序列具有同源性，为同一序列；在轻链基因克隆中，获得一个无功能的轻链产物，它来自杂交瘤亲代细胞之一骨髓瘤细胞 SP2/0. 有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道，最突出的特点是其轻链基因的第 23 位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸（Cys）. 如 L25，L610 等上游引物扩增出来的 cDNA 片段，均为这种无功能的轻链产物. L1，L11, L12 等上游引物扩增出来的 cDNA 片段测序，经核实证明，缺失 FR1 和 CDR1 功能区. 唯有 L13 上游引物扩增出来的 700 bp 的 cDNA 片段为有功能
21、的轻链基因产物. 为得到完整的 Fab 段基因序列，取 H1 和 L13 引物 PCR 产物做TA 克隆. 测序结果用 BLAST 和 DNAman 软件分析，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码. 目前国内外尚未见抗 cTnI 抗体基因序列相关报道 . 在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为 AY484430，AY484431. 抗人 cTnI 抗体的 Fab 段基因的克隆及序列分析为抗人 cTnI 嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】1 张寄南，杨国平，苏恩本, 等.血清肌钙蛋白 I 诊断急性心肌梗塞的研究J，中华心
22、血管病杂志，1997, 25(5), 379-382.2 张寄南，苏恩本，魏 瑾, 等.血清肌钙蛋白 I 升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨J，中华心血管病杂志，1999, 27(6), 421-424.3 Nageh T, Sherwood RA, Harris BM, et al. Cardiac troponin I for risk stratification following percutaneous coronary artery intervention in acute coronary syndromesJ. Catheter Cardiovasc Interv, 20
23、01, 55(1), 37-42.4 mith SC Jr, Blair SN, Bonow RO, et al. AHA/ACC Guidelines for Preventing Heart Attack and Death in Patients With Atherosclerotic Cardiovascular Disease: 2001 UpdateJ. Circulation, 2001, 104:1577-1579.5 Clark M, Antibody humanization: a case of the Emperors new clothesJ? Immunol To
24、day, 2000，21(8):397-402.6 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual M, 3th. USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: 96.7 Altschul A, Stephen F, Thomas L. et al. Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programsJ. Nucleic Acids Res
25、,1997，25:3389-3402. 8 Mac Callum RM, Martin ACR, Thornton JT. Antibodyantigen interactions: Contact analysis and binding site topographyJ. J Mol Biol, 1996，262（5）： 732-774.9 Corbett SJ, Tomlinson IM, Sonnhammer EL, et al. Sequence of the human immunoglobulin diversity (D) segment locus: a systematic
26、 analysis provides no evidence for the use of DIR segments, inverted D segments, “minor” D segments or DD recombinationJ. J Mol Biol, 1997， 270（4）, 587-597.鼠抗人 TCR/CD3 单克隆抗体的制备及其初步应用公文易文秘资源网 佚名 2009-2-1 18:19:53 我要投稿 添加到百度搜藏作者：陈宏远,芮雯,花文峰，杜军,蔡绍晖【摘要】 目的 应用 B 淋巴细胞杂交瘤技术，制备鼠抗人CD3 单克隆抗体，并用于 T 淋巴细胞亚类检测作者：陈
27、宏远,芮雯,花文峰，杜军,蔡绍晖【摘要】 目的 应用 B 淋巴细胞杂交瘤技术，制备鼠抗人 CD3 单克隆抗体，并用于 T 淋巴细胞亚类检测。方法 以本室纯化的 CD3 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，取免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合，成功地获得 1 株抗人 CD3 单克隆抗体。经间接 ELISA 测定，杂交瘤细胞培养腹水的抗体效价。结合 SDSPAGE 实验考察单克隆抗体对 CD3 促 T 淋巴细胞增殖活性的作用。结果 杂交瘤细胞培养腹水的抗体含量为 20 mg/mL，效价为 10-7，并对 T淋巴细胞有促增殖活性，检测正常人外周血阳性 T 细胞百分率为(737)。结论 制备的抗人
28、 CD3 单克隆抗体具备较高的纯度和活性，可用于 T 细胞亚类的检测。 【关键词】 CD3；单克隆抗体；杂交瘤Abstract: Objective To detect the CD3 positive T lymphocytes subgroup with the monoclonal antibody of mouse antihuman CD3 antigen of T lymphocyte which produced by B lymphocyte hybridoma technique. Methods Balb/c mice were immunized with CD3 pro
29、tein produced in our laboratory, mixed SP2/0 myeloma with spleen cells of the mice, then obtained an anti human CD3 antigen of hybridoma cell line. The ascitic culture monoclonal antibody titer was determined by indirectELISA, the quantity and molecular weight were determined by SDSPAGE. MTT method
30、was contributed to explore its activity of promoting T lymphocyte proliferation. Results The monoclonal antibody quantity of ascitic hybridoma cell was 20 mg/mL and the titer was 10-7. It had an activity of promoting T lymphocyte proliferation, percentage of T lymphocyte in healthy adult peripheral
31、blood samples was (737).Conclusion This results suggest that the antiCD3 monoclonal antibody had high purity and activity that might be used in the detection of CD3 positive T lymphocytes subgroup, and could be applied in T lymphocyte detection.Key words: CD3;monoclonal antibody; hybridomasCD3 是 T 淋
32、巴细胞的一个分化抗原，表达于所有成熟 T 细胞表面，它是由 5 条肽链非共价结合组成的复合分子，分别称为 、 和 链。其与 TCR 分子以非共价结合形成一个 TCR/CD3 复合受体分子，其中 TCR 是识别异种抗原和自身 MHC 分子多态性决定族的受体，而 CD3 分子并不参与抗原识别，它具有稳定 TCR 结构和传递活化信号的作用。TCR/CD3 复合体是 T 细胞功能和特异性的主要调节者，抗 TCR/CD3 单克隆抗体已在基础研究和临床中都被广泛应用。如何制备质量好、产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题。目前用于生产单克隆抗体的方法有 2 种：利用纯系小鼠生产免疫腹水法和杂交
33、瘤细胞常规体外培养法1,2。鉴于本次试验样品备用于后续的研发，以及腹水法易保持生物学活性、耗时短和易操作等优点，故应用 B 淋巴细胞杂交瘤技术联合腹水法，制备并筛选了 1 株抗人 CD3 单克隆抗体，并对其特性进行了鉴定和检测，获得较为满意的结果，现报道如下。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 纯化抗原、抗体与试剂/盒 CD3 抗原利用基因重组技术制备，由本室纯化并提供。鼠抗人 CD3 单克隆抗体及羊抗鼠 IgG 抗体,APAAP Kit 为 Sigma 公司产品，50()聚乙二醇（PEG,MW1500）等其余细胞融合、免疫检测、分离纯化和 SDSPAGE 电泳试剂，均为进口或进口分装分析纯
34、产品。1.1.2 细胞株及细胞培养液 小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0 细胞系）由中山大学药学院分子生物学实验室保存，7 周龄 SPF 级 BALB/c 小鼠购自中山大学实验动物中心，许可证号：粤监证字 2004A084；完全 RPMI1640 培养液（含 10新生小牛血清）、无血清 RPMI1640 培养液、HAT 培养液和 HT 培养液由 Gibico 公司提供。1.2 方 法1.2.1 免疫小鼠和骨髓瘤细胞准备 将 CD3 纯品的蛋白浓度调整为 1 mg/mL, 取 0.4 mL 与等量的福氏完全佐剂混合、乳化,注射于 Balb/C 小鼠腹腔，每只小鼠 0.2 mL。2 周后，同样剂量的 CD
35、3 与等量的福氏不完全佐剂混合、乳化, 加强免疫。 融合前 3 d，尾静脉注射100 g CD3 蛋白。将小鼠骨髓瘤细胞用完全 RPMI1640 培养液在培养瓶中进行扩大培养。选择生长旺盛、活力大于 95的骨髓瘤细胞，收集于 50 mL 离心管中，1 000 r/min 离心 15 min。弃上清液，沉淀细胞用无血清 RPMI1640 培养液洗涤 2 次，1 000 r/min 离心 15 min。用无血清 RPMI1640 培养液重悬末次沉淀细胞，计数活细胞，配成 1106 细胞/mL，以备融合使用。1.2.2 免疫小鼠脾细胞悬液的制备 无菌条件下取免疫小鼠脾脏，置培养皿中的 200 目不锈
36、钢网上。加少量无血清 RPMI1640 培养液，用注射器平端将脾脏轻轻压过钢网，取出钢网，用滴管轻轻吹吸分散细胞。再以 RPMI1640 培养液洗涤一次，1 000 r/min 离心 10 min。沉淀细胞重悬于 50 mL 无血清 RPMI1640 培养液，计数淋巴细胞，以备融合使用。1.2.3 细胞融合 取制备好的骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞，以 18 比例在 50 mL 离心管中混合，1 000 r/min 离心 10 min。弃尽上清，轻轻叩松留存管内的沉淀细胞。将细胞、50PEG 及无血清 RPMI1640 培养液均置于 37 水浴箱中预温。将 50PEG 0.8 mL 于 1 min内逐
37、滴加入细胞沉淀中，37 水浴箱中静置 1 min。逐渐加入预温的无血清 RPMI1640 培养液 30 mL,轻轻摇动试管，5 min 内加完。在室温中以 1 000 r/min 离心 10 min。弃上清，沉淀细胞用 10 mL 含小牛血清的 HAT 培养液重新悬浮。滴加于预先铺有饲养细胞的 96孔培养板中，每孔 100 L。置 37 、5CO2 孵箱培养。1.2.4 杂交瘤细胞的克隆化 采用有限稀释法。于 96 孔平底微量培养板制备巨噬细胞培养层3，用一块板作阳性孔杂交瘤细胞的克隆化。收集并计数各阳性孔中的细胞。分别制备细胞数目为 20、10、5 /mL 的细胞悬液。分别加入 96 孔培养
38、板，每孔 100 L。培养板置37 、5CO2 孵箱培养。12 周可观察到克隆生长。检测上清中的抗体，将阳性孔中杂交瘤细胞再次选出培养并作克隆化。1.2.5 杂交瘤细胞系的建立与维持 每只小鼠腹腔内注射 0.5 mL 降植烷。7 d 后于小鼠腹腔内注射 1106 杂交瘤细胞，2 周后大多数可产生实体瘤和腹水。用注射器抽出腹水，在 4 以 2 000 r/min 离心 15 min，备用腹水冻存于-70 。小鼠存活期间可重复上述最后一步。1.2.6 单克隆抗体的提取与纯化4 取上述收获的腹水加等量 PBS，于搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵。 冰浴 30 min，2 500 r/min,30 m
39、in，使其充分沉淀。将所得沉淀物以1 mL PBS 溶解至装入透析袋。对 PBS 充分透析、除盐换液 3 次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色。将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以紫外分光度计测蛋白含量。单克隆抗体的进一步纯化按照 Protein A Agrose 说明书进行。SDS PAGE （10的分离胶和5的浓缩胶）结合分光光度计检测样品浓度。间接 ELISA 法检测收集腹水的效价。1.2.7 纯化抗 CD3 单克隆抗体刺激 T 细胞活化的活性检测 采用 MTT 法。采集肝素抗凝的正常人静脉血, 以 FicollHypaque 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞, 再以尼龙毛柱法分离纯化
40、 T 细胞。取 100 L(1109 细胞/L ), 用流式细胞仪分析 T 细胞的纯度， 其余用于刺激 T 细胞活化的活性分析。96 孔板上用羊抗鼠 IgG 包被（50 倍稀释，加 50 L/孔）：加入 50 倍 PBS 稀释羊抗鼠 IgG 50 L/孔，4 过夜。弃上清。加入 1BSA （PBS稀释）100 L，37，3 h，弃上清用 PBS 洗 2 次。4 保存。RPMI1640 培养液稀释纯化的单克隆抗体（设 110、1100、1500 三个稀释度），每孔 100 L，以培养基为对照组，设 3 个复孔，向各孔中分别加入 100 L 的 T 淋巴细胞悬液（2104），37 、5%CO2 培
41、养。72 h 后，取培养板每孔加 MTT 液 20 L，继续培养 4 h，2 500 r/min 离心 10 min，弃上清培养液，每孔加 Formazan 裂解液 100 L，待其沉淀溶解，在测定波长 570 nm，参比波长 630 nm 下测定吸光度。1.2.8 碱性磷酸酶抗碱性磷酸(APAAP)桥联酶标法测定 T 细胞亚群5,6 常规法 FicollHypaque 密度分离法，分离健康人外周血单个核细胞，洗涤后用含 10()FCS 的 PMI1640 调整细胞浓度至 110mL 。桥联酶标法操作安装说明书进行：取 100 L 细胞悬液滴加在干净载玻片上，风干，用纯丙酮固定。PBS 洗 3
42、 次，每次 2 min,干燥，用蜡笔画圈标记细胞所在位置。加一抗（自制鼠抗人单克隆抗体）10 L，37 湿盒孵育 30 min; PBS 浸洗 5 min，擦片。加二抗 150 羊抗鼠 IgG 10 L， 37 湿盒孵育 30 min; PBS 浸洗5 min，擦片。加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(1 2 000)复合物 10 L。37湿盒孵育 30 min; PBS 浸洗 5 min，擦片。加碱性磷酸酶底物 10 L，37 湿盒孵育 30 min; PBS 浸洗 5 min，擦片。Mayer 苏木精复染 1 min，自来水下冲洗,镜检。2 结果与分析2.1 单克隆抗体的制备应用 B 淋巴细胞杂交
43、瘤技术，进行 4 次细胞融合，平均融合率约 95%。将所得阳性克隆孔进行有限稀释克隆化 45 次，直到亚克隆的阳性率均达到 100%。最后获得 1 株杂交瘤细胞。经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，分泌抗体水平未见下降。说明已是稳定分泌鼠抗人 CD3 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.2 单克隆抗体含量测定将杂交瘤细胞的腹水和精制单克隆抗体 10 L 进行 SDSPAGE（如图 1），可见重链和轻链的分子量分别为 55 和 25 kD 的条带。用先盐析后透析，然后再用 Protein A Agrose纯化，单克隆抗体浓度为 20 mg/mL; 所得纯品经 10 倍逐级稀释，用间接 ELISA 法
44、检测腹水的效价为 110-7。2.3 抗 CD3 单克隆抗体刺激 T 细胞活化的活性分析以 FicollHypaque 密度梯度离心法分离 PBMC, 再通过尼龙毛柱法纯化 T 细胞， 用 FITC 标记的抗 CD3 单克隆抗体进行流式细胞术分析。结果表明, T 细胞的纯度为 86.9 %。用纯化的单克隆抗体刺激纯化的 T 细胞, 同时设阳性及阴性对照, 作用 72 h 后， 加入 MTT 液继续培养 4 h，收集细胞, 测定吸光度。结果显示与对照组相比, 抗 CD3 单克隆抗体具有明显的 T 细胞刺激活性。24 桥联酶标法测定 T 细胞亚群通过对空白对照和试验组玻片的显微镜镜下观察，计数 1
45、00 个细胞，可计算出阳性细胞率。镜下可见（如图 2）阳性细胞细胞膜上或胞质着色为红色，胞核为蓝色（箭头 1 所示）。阴性细胞细胞膜上或胞质着色为无色，胞核为蓝色（箭头 2 所示）。统计学分析得出 CD3 阳性 T 细胞百分率(n=20， s)为（737）。3 讨 论自第一个 T 细胞 CD3 分子特异性的单克隆抗体 OKT3 在首届国际白细胞分化抗原会议上得到公认以来，目前许多实验室已生产出众多抗 TCR/CD3 复合体分子的单克隆抗体，不同的单克隆抗体在亲和力、免疫球蛋白类和亚类及其特异性上不尽相同。本研究以基因重组表达 CD3 为免疫原，加佐剂进行基础免疫后，经融合、筛选及克隆化，得到
46、1 株分泌抗 CD3 单克隆抗体的杂交瘤细胞。取之连续 3 次克隆化后达 100阳性。用此杂交瘤细胞制备的腹水效价为 10-7。该细胞株经体外连续培养半年及液氮反复冻融多次，其分泌单克隆抗体的能力不变,表明上述方法免疫成功。为了获得高纯度的单克隆抗体，采用了盐析和透析相结合的方法。考虑到蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故将腹水以 PBS 作等倍稀释后再盐析。离子强度也可影响蛋白质沉淀，当硫酸铵饱和度为 33时 球蛋白析出。实验还发现蛋白沉淀后宜在 4过夜，更易于形成较大沉淀而易于分离。抗 CD3 单克隆抗体蛋白的检测采用 Wester
47、n blot 法7。取抗 CD3 单克隆抗体进行 SDSPAGE，再用 BioRad 公司的蛋白转印系统，转印至硝酸纤维素膜上,以 HRPmMcAbCD3 进行检测, 经相应试剂盒鉴定本单克隆抗体的重链为小鼠 IgG2a 亚类，轻链为 型。T 细胞是由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成8，由于它在胸腺内分化成熟故称为 T 细胞。成熟 T细胞由胸腺迁出，移居于周围淋巴组织中淋巴节的副皮质区和脾白髓小动脉的周围。不同功能成熟的 T 细胞均属小淋巴细胞，在形态学上不能区分，但可借其细胞膜表面分子不同加以鉴别。故本次制得抗 CD3 单克隆抗体可作为 T 淋巴细胞鉴定的物质基础，用于相关试剂盒的研发。结合
48、本次实验结果，还可以用其进一步联合其他单克隆抗体测定 CD4 和 CD8 阳性细胞的百分率，以提高检测细胞功能以及分类的准确率。此外，本文制备的鼠抗人 TCR/CD3 单克隆抗体，可为单克隆抗体结合其他技术（如放射免疫分析）提供物质基础，这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有一定的实际意义。【参考文献】1 JASPERT R，GESKE T，TEICHMANN A，et alLaboratory scale production of monoclonal antibodies in a tumbling chamberJJ Immunol Methods，1995，178：77.2 SUSAN KER HWE OU，PAUL H P，TERSON TA more efficient and economical approach for monclonal antibody productionJJ Immunol Methods，1997，209：105.3 PAN Hui, JIANG Hongliang.A fibroblast/macrophage coculture mod
