1、融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 的抗菌活性及对猪淋巴细胞免疫活性的调节研究贾倩倩 #, 万小平 #,杨肖, 李飞林, 高荣*（四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川省动物疫病防治和食品安全重点实验室，成都，610064）摘要：为研究融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2的抗菌活性和对猪免疫细胞的刺激作用，将融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2分别加入细胞培养液中，对从长白猪的新鲜血液中分离出免疫细胞进行体外培养，采用MTT法进行融合抗菌肽免疫活性实验。同时采用微量稀释法、琼脂糖弥散法及耐热活性试验，通过测定最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)和抑菌圈大小，
2、检测两种融合抗菌肽对多种致病菌及耐药菌的抑制作用。结果发现融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2 基因工程酵母菌发酵上清液及其细胞裂解分子均对猪淋巴细胞有明显的免疫刺激活性，能显著的促进猪免疫细胞的分裂增殖活性（P0.05） ，具有提高其免疫机能的作用；融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2样品液对猪免疫细胞的促分裂增殖活性明显强于融合抗菌肽MAPWA样品液，具有更好的免疫增强调节作用。融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2对多种革兰氏阳性和阴性致病菌及耐药菌均表现出较强的抑菌杀菌活性和较高的耐热活性，因此，融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2具有高效、广谱的抗菌效果，有较高的应用潜力和开发前景，为新型免疫
3、调节生物制剂的研发奠定了初步基础。关键词：抗菌肽；抗菌活性，猪，淋巴细胞；增殖活性；抗菌肽是生物机体防御系统产生的对抗外界病原体感染的肽类活性物质，广泛存在于从原核生物到人类的生物体中 1。虽然 Boman.GH(1972)以前，不少学者从不同生物中分离、鉴定了一批具有抗菌、抗病活性的小分子多肽，但真正被人们重视并引入科研领域的则是天蚕素（Cecropin）的发现。对这一类具有活性的小分子多肽统一命名为抗菌肽。进一步研究证明抗菌肽不仅具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功用 2-4，而其还能调节机体免疫及促进免疫功能的作用 5-6，是目前公认的替代抗生素的优良制剂。本实验将融合抗菌肽 MAPWA 和 P
4、GBD-2 分别加入细胞培养液中，对从长白猪新鲜血液中分离出的免疫细胞进行体外培养，探索其对淋巴细胞的体外免疫刺激作用及其抗菌活性、抗菌谱及稳定性，为融合抗菌肽制剂进一步的动物实验提供科学依据和参考。#:共同第一作者; *: 通讯联系作者，;【作者简介】 贾倩倩（1986），女，山东省烟台市人，硕士研究生，研究方向：动物生长免疫调控。E-mail：万小平（1987），男，四川省武胜县人，博士研究生，研究方向：动物免疫调控。E-mail：*【通讯作者】 高荣（1966），男，四川省西昌市人，博士生导师，研究方向：动物传染病和微生物学。E-mail：1 材料和试剂1、 融合抗菌肽 MAPWA 和
5、PGBD-2 基因工程酵母菌发酵上清液及酵母细胞裂解物：成都市金芝源生物技术公司提供；2、 猪淋巴细胞：分离自长白猪抗凝血液；3、 MTT：四甲基偶氮唑兰，Sigma 公司提供；4、 1640 RPMI 淋巴细胞培养基：Sigma 公司生产；2 实验方法2.1 免疫细胞的分离 按猪淋巴细胞分离液使用说明，从新鲜采取的 3 mL 前腔静脉抗凝血中分离免疫细胞，用 RPMI1640 培养液（含青霉素 100 U/mL，链霉素 100 g/mL 和 10%胎牛血清）悬浮。取10 L 细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至 5106/mL，置于细胞培养板。2.2 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 对免
6、疫细胞的增殖刺激活性检测 1、 将上面分离和收集到的长白猪血液单个核免疫细胞，以 1640 培养基调节细胞悬液浓度1106cell/ml；2、 分别加入待检样品液融合抗菌肽 MAPWA 发酵上清液（P1-1）、融合抗菌肽 MAPWA 细胞裂解分子（P1-2）、融合抗菌肽 PGBD-2 发酵上清液（P2-1）和融合抗菌肽 PGBD-2 细胞裂解分子（P2-2）各 25ul；免疫细胞悬液 50ul（即 5104cell/孔），共 100ul 加入到 96孔板。每板设对照孔（加 100ul 完全 1640 培养液）。3、置 37，5%CO2 孵育 16、24、48 和 72 小时，倒置显微镜下观察细
7、胞生长状态。4、培养 16、24、48 和 72 后，每孔分别加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。每孔加入 100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在 Bio-Rad3550 酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各样品孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的 MTT、二甲基亚砜、培养液），每样品设 4 个重复孔。2.3 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定最小抑制浓度(MlC)的测定: 微量稀释法测定融合抗
8、菌肽对大肠杆菌、鼠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌进行最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)的测定。具体操作方法参照文献进行：把处于对数生长期 OD600 约 0.5-0.7(细菌计数约 1x107CFU/ml)的指示菌用 LB 培养液稀释到 OD600为 0.05，分别接种到 96 孔细胞培养板上，每孔接种 100ul。将融合抗菌肽用pH6.0 的 0.lmol/LpBS 分别倍比稀释成 0.25ug/ml、0.5ug/ml、1.0 ug/ml 至
9、 128ug/ml；各取 100ul 分别加入培养孔中，混匀，每组重复 3 个孔，设只加 LB 培养液的孔为阴性对照，接种细菌而不加抗菌肽的 LB 培养液为阳性对照。置 37培养箱孵育 16h 后取出，用紫外分光光度计测量培养液的 OD600值，结果判断以无 OD 值变化的孔中抗菌肽的浓度(终浓度)即为最小抑菌浓度。再将 MIC 附近各管培养液点种到 LB 固体培养基上，37培养 12h，无细菌生长的药物最小稀释浓度即为最小杀菌浓度(MBC)值。2.4 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 对不同细菌的抗菌活性测定一琼脂糖弥散法在直径为 10cm 的平皿内倒入琼脂(含 1.2%琼脂糖，0.
10、03%营养肉汤粉，pH 值为 6.0)层和终浓度为 106CFU/ml 的处于对数生长期的细菌，琼脂层倾注厚度为 1.5mm。待琼脂凝固后，在琼脂板上打 3mm 直径的圆孔，孔中加入金源肽分子(80ug/ml)，每孔上样量为 15.0ul，将平皿置于恒温培养箱中 37培养 18h，测量各组的抑菌圈直径，用以表示抗菌活性(抗菌活性=抑菌圈直径-3)。2.5 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 的热稳定性将融合抗菌肽液沸水浴 5min、10min、15min、20min、25min、30min，再按上述方法进行抑菌试验，检测其抗菌活性的变化，以空载体转化酵母的表达上清和未煮沸的融合抗菌肽对照
11、。3 结果与分析3.1 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 对猪免疫细胞的刺激增殖活性结果如下表 1表 1 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 刺激猪免疫细胞增殖活性结果（OD 570-630， XSD）12 24 48 72空白细胞对照（Control）0.2100.027c 0.2580.021c 0.2650.017c 0.3330.029cP1 发酵上清液（P1-1） 0.3140.018b 0.3570.026b 0.4090.035b 0.5990.044bP1 细胞裂解分子（P1-2）0.2960.019b 0.3590.029b 0.4540.044b 0.5980
12、.051bP2 发酵上清液（P2-1） 0.3600.022a 0.4710.066b 0.4960.040b 0.7010.042bP2 细胞裂解分子（P2-2）0.4410.028a 0.4810.053a 0.5340.047a 0.7120.052a图 1 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 刺激猪免疫细胞增殖活性变化从表 1、图 1 中可见：融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 发酵液及其细胞裂解提取分子均对猪的免疫细胞有显著的激活作用，与对照组比较，其差异极其显著（P0.01）,而 P2 的免疫刺激作用又明显高于 P1 分子。3.2 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-
13、2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度通过微量稀释法获得的抗菌肽对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的MIC 和 MBC 见表 2。抗菌肽种类 PGBD-2 MAPWA菌种 MIC（ug/ml） MBC（ug/ml） MIC（ug/ml） MBC（ug/ml）大肠杆菌 K99 2.20.16 4.10.23 4.30.46 8.20.31鼠伤寒沙门氏菌 2.60.17 4.50.18 3.30.46 6.40.42金黄葡萄球菌 2.80.15 3.80.19 4.00.46 6.70.34肺炎链球菌 3.50.21 4.80.26 5.00.46 6.80.28表 2、融合抗菌肽的最小抑菌
14、浓度和最小杀菌浓度3.3 融合抗菌肽的抗菌谱检测表 2 真核表达融合抗菌肽的抗菌谱结果抗菌活性菌株名 PGBD-2 MAPWAE.coli DH5a + +E.coli K99 + +鼠伤寒沙门氏菌 + +耐药沙门氏菌 + +金黄葡萄球菌 + +耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）+ +猪链球菌 + +肺炎链球菌 + +抑菌圈大小表示抑菌活性强弱，+：1.0-1.5cm；+：1.6-2.0cm; +:2.1-3.0cm3.4 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 的热稳定性从图 2 结果发现：煮沸 10-30 分钟，融合抗菌肽的抗金黄葡萄球菌活性无明显改变; 表明抗菌肽具有比较强的热稳定性
15、。图 2 融合抗菌肽分子抗菌活性热稳定性结果四 讨论MTT法是 Mosmannf 8在 1 9 8 3年首先报道的。现已被美国 NC I 选为体外抗癌药物筛选的常规方法。其优点是简便、快捷 、经济且与生产实际相关性好。从众多体外药敏试验中脱颖而出。 MTT法适用于来自新鲜组织标本的细胞 。一些研究者报道体外 MTT与体内的反应有高度相关性 7,9-10 。 融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 基因工程酵母菌发酵上清液及其细胞裂解分子均对猪淋巴细胞有显著的免疫刺激活性，能促进猪免疫细胞的分裂增殖和生长，达到提高其免疫机能的作用。融合抗菌肽 PGBD-2（P2）样品液对猪免疫细胞的促分裂增殖
16、活性明显强于融合抗菌肽 MAPWA（P1）样品液，具有更好的免疫增强调节作用。融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和肺炎链球菌均表现了较强的抑菌和杀菌作用。其中，融合抗菌肽 PGBD-2（P2）相较融合抗菌肽MAPWA（P1）有更好的抑菌杀菌效果。但融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 的 MBC 值均稍高于 M IC 值,说明两种抗菌肽在低浓度时均具有良好的抑菌效果,但要达到杀菌要求,则需稍提高其浓度。所以,在实际应用中应根据具体需求,采用不同的浓度,达到合理使用的目的。凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素。广谱抗生素抗菌
17、范围广，容易产生耐药、二重感染等，针对性不如窄谱抗生素强。但在本次试验中，融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2对不同的致病菌，甚至是耐药菌（及特异性耐药菌）进行了抗药谱检测。结果显示，融合抗菌肽MAPWA 和 PGBD-2 对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，或是不同种属的球菌、杆菌或链球菌等等，都具有较强的抗菌活性。尤其是对一些耐药菌，如耐药沙门氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） ，同样具有较强的抗菌作用。由此显示，融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 不仅具有高效广谱的抗菌活性；而且相较一般广谱抗生素针对性不强、易产生耐药性等缺点，融合抗菌肽 MAPWA和 PGBD-2 对具有不
18、同耐药性的耐药菌，同样有较强的抗菌活性，这使其具有更广阔的研究应用前景和更大的潜在价值。与此同时，本实验还进行了融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 抗菌活性的热稳定性实验,实验结果显示煮沸 10-30 分钟，融合抗菌肽的抗金黄葡萄球菌活性无明显改变，表明融合抗菌肽 MAPWA和 PGBD-2 具有比较强的热稳定性。因此，作为一种抗菌物质，融合抗菌肽 MAPWA 和 PGBD-2 具有高效广谱的抗菌效果，有传统抗生素多不具备的多种优点，更有利于科学研究和进一步的生产应用，有很高的应用潜力和开发前景。本实验的结果也为后续的科研试验和生产应用提供了相关资料，为融合抗菌肽制剂进一步的动物实验提供
19、科学依据和参考。参考文献1 Giuliani A, Pirri G, Nicolotto S F. Antimicrbial peptides:an overvivew of a promising class of therapeuticsJ.Central European Journal of Biology,2007,2( 1):1-332万遂如 . 抗菌肽在猪病防制中的应用 . 吉林畜牧兽医 ,2007(5):24-25.3覃小荣.抗菌肽对保育猪生产性能与健康水平的影响. 饲料研究 2011(4):6-84 安春菊 ,石明 .家蝇幼虫抗菌相关蛋白 /多肽的诱导及抗菌活性分析 . 昆虫
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21、 cellular growthand survival:application to proliferation and cytotoxicity assaysJ.J Immunol Methods ,1983,65(1) :55-63 9Kawada K,Yonei T,Veoka H,eta1.Comparison of the mosesitivity test :donogenic assay versus MTT assay J .Actamedokayama ,2002,56 (3):129-13410曹丽芝.MT T 法对恶性淋巴瘤的药敏检测及临床应用研究 . 实用医学杂志.2
22、010,2 (20)高荣博士简介 分子生物学博士，四川大学生命科学学院教授，博士生导师。四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室副主任，四川省学术技术带头人，Biomaterial、Vaccine、Immonology和Research in Veterinary Science等国际著名学术期特邀刊审稿专家，国家自然科学基金评议专家，国家科技部、教育部、四川省和成都市科技进步奖评审专家。获省级科技进步二等奖 3 项，省教委科技进步一等奖 1 项、二等奖 1 项；主持或主研欧盟国际合作、国家自然科学基金、国家 863 计划、重大基础项目、教育部、四川省等 20 多项重点科研课题研究，在国内外核心学术刊物发表科研论文 70 多篇，其中 SCI、EI 论文 30 多篇，已获得或申请技术发明专利共 17 项，培养、指导硕士生、博士生和博士后 32 人。先后受邀多次到美国、澳大利亚、丹麦、英国进行访问和学术交流。
