1、异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测 *张晓君 1，阎斌伦 1，邴旭文 2，秦蕾 1，秦国民 1(1.淮海工学院海洋学院，江苏省海洋生物技术重点建设实验室，连云港 222005；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，无锡 214081)摘要：2008 年 10 月江苏盐城大丰精养异育银鲫（Carassius auratus gibelio) 发生严重疾病，从病鱼肝脏、血液及腹水中分离到优势生长的细菌。对分离做纯培养的 4 株菌(JY081016-1 至 JY081016-4)进行形态特征、理化特性等表型生物学性状检 验 ；
2、测定了菌株（JY081016-1）的 16S rRNA 和gyrB 基因序列，分析了 16S rRNA 和 gyrB 两种基因序列的同源性，并构建了系统发生树。结果表明分离菌对供试健康异育银鲫有强致病性，菌株（JY081016-1 ）所扩增的 16S rRNA 基因序列长度为 1448bp（GenBank 登录号： GQ232759） ，所扩增的 gyrB 基因序列长度为 1177bp（GenBank 登录号：GQ232760） ，其 16S rRNA 和 gyrB 基因序列与 GenBank 数据库中维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型的 16S rRNA 和 gyrB 基因序列相似性均在
3、97%以上；根据分离菌的表型及分子特征，判定分离鉴定的 4 株菌为温和气单胞菌（Aeromonas sobria） 。胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶，在含 7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈 型溶血；设计的特异性引物可扩增出溶血素基因。关键词：异育银鲫；温和气单胞菌；16S rRNA 基因；gyrB 基因；溶血素基因中图分类号： 文献标识码: 文章编号：Detection of hemolysin gene and phenotypic and molecular identification of pathogenic Aeromonas sobria from
4、 gibel carp (Carassius auratus gibelio) ZHANG Xiao-jun1, YAN Bin-lun1, BING Xu-wen2, QIN Lei1, QIN Guo-min1(1. College of Ocean, Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, Jiangsu 222005; 2. Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Bio
5、logy of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Science, Wuxi, Jiangsu 214081 )ABSTRACT In October 2008, high mortalities of cultured gibel carp occurred in some farms of Yancheng city of Jiangsu province, dominant bacteria were is
6、olated from liver, kidney, bleed and ascitic fluid. The phenotypic characteristics of four strains (JY081016-1 to JY081016-4) were examined, including morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics, the 16S rRNA and gyrB were amplified by PCR and compared with sequences
7、 deposited in databases, molecular phylogenetic trees were constructed. The results showed the isolates have strong pathogenicity to healthy gibel carp by artificial challenge; the amplified 16S rRNA gene of strain JY081016-1 (GenBank accession No. GQ232759) was 1448bp in length, the amplified gyrB
8、gene (GenBank accession No. GQ232760) was 1177bp in length, and two genes all exhibited high similarity (over 97%) with the 16S rRNA and gyrB gene of Aeromonas veronii and A.veronii bv.sobria from GenBank database; the isolates were identified as Aeromonas sobria based on their phenotypic and molecu
9、lar characteristics. Detection of the activity of extracellulase and hemolysin showed that the isolate could produced proteinase, lipase, lecithinase, and with-haemolysis in containing 7% defibrinated rabbit blood agar plates, and hemolysin gene could be amplified by PCR using specific primer.KEY WO
10、RDS Gibel carp (Carassius auratus gibelio); Aeromonas sobria; 16S rRNA gene; gyrB gene; hemolysin gene*农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室开放基金资助（BZ2009-03） ；江苏省自然科学基金项目（BK2009163）作者简介：张晓君（1969），女，博士，教授，主要从事水产动物病害及病原微生物学研究.E-mail：.温和气单胞菌（Aeromonas sobria Popoff and Vron 1981）亦被称为寡源气单胞菌，也有的将其记作苏伯利气单胞菌，分类于气单胞菌科（A
11、eromonadaceae Colwell MacDonell and Deley 1986）气单胞菌属（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936） 。该菌为条件致病菌，可以引起多种水产养殖动物的感染发病，可单独引发感染或与嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌及其他病原菌混合感染，有报道该菌可导致鳗鲡、罗非鱼、河鲈、暗纹东方鲀、牛蛙、中华鳖、大鲵等感染发病 1-7，近年也有在冷血动物、水禽等引起感染发病的报道 8-9，另外，该菌可导致人类的食物中毒、腹泻、宫颈糜烂等疾病10，属于人兽共染的病原细菌。2008 年 10 月江苏省盐城市大丰几家养殖场所精养的异育银鲫发生疾病，病
12、情严重，病鱼死亡惨重，所养异育银鲫 500 亩左右，异育银鲫鱼种重 3040 克，投喂商品颗粒饲料。对送检的 30 尾（来自 5 家养殖户）濒死或新鲜死亡异育银鲫进行了检验，病鱼表现为眼球突出，部分病鱼鳃框有血丝，鳍条中央变白，鳞片疏松，腹部膨胀，剖开鱼腹，可见腹腔积有大量黄色腹水，肝脏颜色变白，肾脏轻微肿大，个别病鱼内脏外有一层淡黄色胶冻状物。取被检鱼的肝脏、肾脏、腹水及血液做细菌学及致病性检验，结果表明其病原为气单胞菌属（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936）的温和气单胞菌（Aeromonas sobria） 。为丰富该菌在生物学性状、宿主范围及分子生物学
13、等方面的内容，对其进行了致病性、形态特征、理化特性、16S rRNA 基因和 gyrB 基因序列及系统发育学、对抗菌类药物的敏感性及胞外酶及溶血素等毒力因子检测，旨在能为对该菌的有效检验及深入研究等提供一定的参考。1 材料与方法1.1 病原菌的分离取病死异育银鲫肝脏、血液及腹水，抹片后革兰氏染色镜检；划线接种于普通营养琼脂培养基平板，取优势生长的 4 个菌落（编号为：JY081016-14）移接于普通营养琼脂斜面（28培养 24h）进行纯培养供鉴定。1.2 致病性试验 试验用异育银鲫购自水产品批发市场，暂养 1周经检验健康后进行试验。将供试菌株 JY081016-1 接种于普通营养肉汤，28过
14、夜培养后作为供试菌液（调至106CFU/ml、10 7CFU/ml、10 8CFU/ml） ，分别经腹腔及肌肉注射感染健康异育银鲫，每种浓度接种 6尾，每尾接种 0.2ml；同时设立接种同剂量、同批无菌营养肉汤做对照；均隔离养殖于试验水族箱中，每天观察试验鱼感染后的发病与死亡情况，以引起试验鱼发病死亡并能重新分离回收到原感染菌作为分离菌致病性的判定指标。1.3 病原菌表型特征检验 取纯培养菌涂片，经革兰氏染色后镜检细菌形态；纯培养菌接种于普通营养肉汤、普通营养琼脂及硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂（TCBS）培养基，置 28培养24h，检查生长情况。理化特性测定主要参照常见细菌系统鉴定手册
15、 11及人及动物病原细菌学12进行。1.4 病原菌胞外产物检测分离菌的胞外蛋白酶活性、卵磷脂酶活性、脂酶活性、淀粉酶活性、尿素酶活性采用平板检验方法，明胶酶活性采用试管液化方法。将处于对数生长期的4株供试菌株分别点种于含有脱脂牛奶（10%）、蛋黄液（10%）、吐温80（1.0%）、淀粉（1%）的平板中，将供试菌穿刺接种于含明胶（8%）的培养基试管，于28恒温培养24h后观察。含脱脂牛奶、蛋黄液及吐温80的平板可以直接观察水解圈；含淀粉的平板则在观察之前加入显色剂碘液。透明的水解圈区域显示有酶活。含明胶的培养基试管于28恒温培养24h后，置于4冰箱中过夜后观察。分离菌的溶血活性采用将菌株接种至血
16、液琼脂（含7家兔脱纤血的营养琼脂）培养基平板的方法，将接种后的血液琼脂培养基平板置28恒温培养24h后观察菌株周围是否出现溶血圈。若出现溶血圈则为阳性，表明该菌能分泌溶血毒素。1.5 16S rRNA 和 gyrB 基因序列测定与系统发育学分析1.5.1 PCR 模板 DNA的制备 取纯培养菌分别接种于 LB 肉汤中 28培养 16h，按小量细菌基因组 DNA 抽提试剂盒（上海赛百盛基因技术有限公司产）所述方法提取DNA 作为 PCR 模板 DNA。1.5.2 16S rRNA 基因序列的 PCR扩增与测序 16S rRNA 基因 PCR 扩增的两个引物分别为：27F （正向引物）： 5-AG
17、A GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3，1492R（反向引物）：5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 13。在 20l 反应体系中含有：无菌蒸馏水 14.4l，10PCR 缓冲液 2l，1.5m mol/L MgCl2 1.6l，4dNTP 混合物 0.4l，引物各 0.2l，2.5U/l 的 Taq DNA 聚合酶 0.2l ，模板 DNA 1l。PCR 反应条件为：95预变性 3min、接 94变性 1min、55复性 1min、72延伸 2min，30个循环后 72温育 6min。PCR 扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。1.5.
18、3 gyrB 基因序列的 PCR扩增与测序 gyrB 基因 PCR 扩增的两个引物分别为：UP1（正向引物）：5-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3，UP2r（反向引物）：5-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3 14。在 20l 反应体系中含有：无菌蒸馏水14.4l，10PCR 缓冲液 2l，1.5m mol/L MgCl2 1.6l, 4dNTP 混合物 0.4l，引物各 0.2l，2.5U/l 的 Taq DNA 聚合酶 0.2l
19、，模板 DNA 1l 。PCR 反应条件为：94预变性 5min，接 94变性 1min、57复性 1min、72延伸 2min、30 个循环，然后 72温育 7min。PCR 扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。1.5.4 16S rRNA和 gyrB 基因序列系统发育树构建 对分离菌的 16S rRNA基因和gyrB 基因序列通过 NCBI的 Blast检索系统（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）进行序列同源性分析，并使用 ClustalX软件与从 GenBank数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进行多序列匹配排列（Multiple Al
20、ignments）,采用MEGA3(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA)软件构建系统发生树，采用邻接法（neighbor joining method）建树方法，并通过 Bootstrap 法（1000 次重复）检验。1.6 菌种分类位置确定根据细菌形态、培养及理化特性测定的结果，主要依据Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed 15、 Bergeys Manual of Systematic Bacteriology 16及有关资料，并结合细菌发育学分析的结果，进行分离菌的
21、种属分类位置判定。1.7 溶血素基因的检测根据Fujii等 17报道的温和气单胞菌溶血素基因序列设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用于溶血素基因序列的扩增。P 1序列为5GGA TCC ATG ATG AAT AGA ATA 3，P 2序列为5AAG CTT TTA TTG AAC CGG AAC 3。PCR反应体系、反应参数及模板DNA的制备按前述1.3.2方法进行，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。2 结果 2.1 病原细菌检验与分离在被检异育银鲫的肝脏、血液和腹水中，均存在大量革兰氏阴性、散在或成双排列、两端钝圆、无芽孢、大小多在 0.51.0m1.02.0m的杆菌（个
22、别菌体稍弯曲） 。自被检异育银鲫的肝脏、血液和腹水中均分离到了大量同种细菌。培养 24h 检查其菌落特征为圆形光滑、不透明、隆起、乳白色、有光泽、边缘整齐、直径多在 1mm左右，48h 的菌落直径多在 1.5mm 左右，生长良好。2.2 分离菌的致病性供试菌株（JY081016-1）腹腔及肌肉注射感染异育银鲫后，供试鱼于感染后 34天陆续死亡并出现明显的体表出血、鳞片疏松、脱落等病变。对照组异育银鲫在 14d观察期内均正常；取感染死亡鱼进行细菌学检验，结果均检验并分离到大量纯一的同供试菌株（JY081016-1）在形态及菌落特征上相似的菌落。试验证明分离菌为本次引起异育银鲫大量死亡的病原菌。2
23、.3 形态与生长特性4 株分离菌的形态一致，均为革兰氏染色阴性、杆状、散在或成双排列、无芽孢、大小多在 0.40.8m1.22.0m 的细菌。4 株分离菌在普通营养琼脂上的菌落特征，与从病鱼肾脏和腹水中直接分离的一致，生长良好；在 TCBS培养基上易生长，形成黄色菌落；在普通营养肉汤培养基（管）中，28培养 24h 检查呈均匀混浊生长，管底有点状菌体沉淀。2.4 生理生化特性 分离菌所测主要理化特性的反应结果见表 1。表 1 分离菌与 4 种嗜温有动力气单胞菌理化特性比较表Table 1 Physiological and biochemical characteristics of isol
24、ates and 4 mesophilic motile aeromonads特性 Character 分离菌Isolates嗜水气单胞菌 aA.hydrophila温和气单胞菌 aA.sobria豚鼠气单胞菌 aA.caviae维氏气单胞菌 aA.veronii37生长 Growth at 37 + + + + +氧化酶 Oxidase + + + + +接触酶 Catalase + + + + +O-F试验 O-F test F F F F F动力 Motility + + + + +葡萄糖: 产酸 Glucose,acid production + + + + +产气 gas produ
25、ction + + + - +乳糖 Lactose - d - d -麦芽糖 Maltose + + + + +甘露醇 Mannitol + + + + +甘露糖 Mannose + + + d +蔗糖 Sucrose + + d + +阿拉伯糖 Arabinose - + - + -阿拉伯醇 Arabitol - - - - -木糖 Xylose - - - - -半乳糖 Galactose + + + + +山梨醇 Sorbitol - - d - -山梨糖 Sorbose - 卫茅醇 Dulcitol - - - - -赤鲜醇 Erythritol - - - - -苦杏仁苷 Amygd
26、atin - 鼠李糖 L-Rhamnose - - - - -糊精 Oextrin + 肌醇 Inositol - - - - -侧金盏花醇 Adonitol - 水杨苷 Salicin - + - + +胆汁七叶苷 Esculin - + - + +-半乳糖苷酶 ONPG + + - + +丙二酸盐利用 Malonate - - - - -枸橼酸盐利用 Citrate + d - d +醋酸盐利用 Acetate + d d d +酒石酸盐利用 Tartrate - - - - +黏液酸盐利用 Mucate - - - - -苯丙氨酸脱氨酶 Phenylalanine deaminase-
27、- + - +蕈糖 Trehalose + + d + +棉子糖 Raffinose + - - - -果糖 Fructose + 蜜二糖 Melibiose + - - - -纤维二糖 Cellobiose - - +/- +/- +甲基红 MR test + + - + +V-P试验 V-P test + + d + +葡萄糖铵 Glucosamine + 尿素酶 Urease - - - - -H2S产生 H 2S production - + - - -乙酰胺酶 Acetamidase - 硝酸盐还原 Nitrate reduction - + + + +-甲基-D-葡糖苷 -meth
28、yl-D-glucoside+ d d - +吲哚 Indole - + + + +NaCl中生长 Growth at NaCl 0 + + + + +1 + + + + +3% + 6 - -O/129敏感性 sensitivity : 10g - - - - -150g - - - - -注：“ ”示阳性， “”示阴性， “F”示发酵型， “d”示 11%89%的菌株为阳性“” 示在原文中无记载。上角标 a 指表中数据取自Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed （1994） 。Notes: “”, positive; “”,
29、 negative; “F”, fermentative; “d”, 11% 89% positive ,“”, not described in primary article. “a”， the data come fromBergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed.2.5 16S rRNA和 gyrB基因序列与系统发育学 分离菌（JY081016-1）所扩增的 16S rRNA 基因序列长度为 1448bp（GenBank 登录号：GQ232759） ；所扩增的 gyrB 基因序列长度为 1177bp（GenBank 登录号：
30、GQ232760） 。将两种基因序列在 NCBI 上通过 Blast 进行同源性检索，结果分离菌的16S rRNA 基因序列与气单胞菌属细菌的 16S rRNA基因序列自然聚类，在检索出的序列中，主要包括维氏气单胞菌（A. veronii） 、维氏气单胞菌温和生物型 (A.veronii bv.sobria)、嗜水气单胞菌（A.hydrophila） 、Aeromonas culicicola、维氏气单胞菌维氏生物型（A.veronii bv. veronii） 、简氏气单胞菌（A.jandaei） 、豚鼠气单胞菌（A.caviae）等，JY081016-1 株与这些气单胞菌的相似性均在 99
31、%，选取了检索出的部分气单胞菌和 1株鳗利斯顿氏菌（登录号 AY662304）作为外围菌进行系统发育学分析，其系统发育树如图 1所示。分离菌（JY081016-1）的 gyrB 基因序列与气单胞菌属细菌的 gyrB 基因序列自然聚类，在检索出的序列中，主要包括维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型（相似性均在 97%98%） 、嗜水气单胞菌（相似性在 92%96%） 、简氏气单胞菌（相似性在 93%）及中间气单胞菌（相似性在 93%） ，以鳗利斯顿氏菌（登录号 AM235736）作为外围菌进行系统发育学分析，其系统发育树如图 2所示。图 1 LY081016-1 株 16S rRNA 基因序列系
32、统发育树 (图中 EF631963 至 AY662304 为菌株在 NCBI 的登录号, 数字为自举值)Fig.1 Phylogenetic tree based on LY081016-116S rRNA gene sequences (EF631963AY662304 were database accession numbers in NCBI, numbers above branches in tree are bootstrap values)图 2 LY081016-1 株 gyrB 基因序列系统发育树 (图中 EU595707 至 AM235736 为菌株在 NCBI 的登录号
33、, 数字为自举值)Fig.2 Phylogenetic tree based on LY081016-1 gyrB gene sequences (EU595707AM235736 were database accession numbers in NCBI, numbers above branches in tree are bootstrap values)2.6 胞外酶活性及溶血活性酶活性实验结果表明，分离菌（JY081016-1）的胞外产物具有蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶活性，但不具有淀粉酶、明胶酶活性。供试菌在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上，呈型溶血现象。2.7 菌种分类位置结合形
34、态观察、普通的生理生化特征、16S rRNA与gyrB基因的分子鉴定结果，判定分 离 菌 为气单胞菌属（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936）的温和气单胞菌（Aeromonas sobria Popoff and Vron 1981） 。2.8 溶血素基因检测用设计的特异性引物进行菌体PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，2株供试菌均可扩增出溶血素基因，见图3。图 3 温和气单胞菌溶血素基因的扩增(M: 2000bp marker; 1, 2: 2株分离菌溶血素基因片段)Fig 3 Amplification of the hemolysin gene of A.so
35、bria (M:2000bp marker; 1,2: hemolysin gene segment of 2 isolates)3 讨 论异育银鲫（Carassius auratus gibelio Bloch) 全名为“异精雌核发育银鲫” ，是以黑龙江方正县的银鲫作母本，江西省兴国县的红鲤作父本进行远缘杂交所获得的优良品种。该品种不仅肉质鲜美，营养丰富，而且食性广，生长快，平均生长速度为银鲫的 1.4倍,为普通鲫鱼的二倍以上，易于养殖，目前是我国淡水养殖鱼类的主要鱼种之一，随着其养殖规模及养殖密度的不断扩大，病害多有发生，尤其是由细菌引起的疾病常呈暴发流行，已成为制约其养殖发展的明显障碍。
36、孙其焕等报道温和气单胞菌和嗜水气单胞菌可引起异育银鲫发生溶血性腹水病，病鲫体表及眼睛充血（腹部、鳍基、下颌、口腔尤为严重） ，肝脏肿大呈花肝、贫血，部分病鲫肠道充血、肛门红肿、有的有腹水，少数有突眼、竖鳞症状 19；此外，嗜水气单胞菌常引起鲫鱼发生出血病 20-21；本次所检江苏盐城市大丰渔业精养异育银鲫病鱼，表现为眼球突出，鳍条中央变白，鳞片疏松，腹部膨胀，腹腔积有大量黄色腹水，肝脏贫血，肾脏轻微肿大，个别病鱼内脏外有一层淡黄色胶冻状物等病变，自病死鱼肝脏、肾脏、血液及腹水有规律地分离到优势生长的细菌并经鉴定表明为温和气单胞菌，对健康异育银鲫具有较强致病性。该项研究证明了温和气单胞菌在本次引
37、起异育银鲫疾病的原发病原学意义，进一步表明了该菌在水产养殖动物中的广泛致病作用。本次对于分离菌的鉴定，在进行常规的形态特征、理化特性等生物学性状检 验 的基 础 上 ， 用 PCR 方 法 同 时 扩 增 了 其 16S rRNA 和 gyrB 基因，通过基因序列的系统发育学分析比较了两种基因对温和气单胞菌的鉴别能力。16S rRNA基因序列在气单胞菌属内具有高度保守性，分离菌（JY081016-1 株）的 16S rRNA基因序列与这些气单胞菌的相似性均在 99%，且系统发生树也难以将分离菌与其所属种聚为一类，可见在气单胞菌分子鉴定中，使用 16S rRNA基因进行属内亲缘关系很近的种间鉴定
38、存在一定的局限性；而编码 DNA 解旋酶 B 亚单位的基因（gyrB 基因）普遍存在于各种细菌中，其序列具有保守性和变异性，其显著优点是基因进化率较快，碱基替换频率较高，在以核苷酸序列为基础的细菌分类及鉴别研究中，可作为靶分子 22。本次扩增分离菌的gyrB 基因序列并在 NCBI 中进行比对与系统发育学分析表明，分离菌（ JY081016-1 株）的 gyrB 基因序列与数据库中的维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型相似性均在97%98%，而与其他气单胞菌相似性在 97%以下，gyrB 基因作为靶分子在气单胞菌属种间鉴别中能达到要求，且系统发生树能将 JY081016-1 株与维氏气单胞菌温
39、和生物型(A.veronii bv.sobria)即温和气单胞菌聚为一类，本次研究进一步表明在相似细菌的检测和鉴别方面 gyrB 基因比 16S rRNA基因更具优越性。温和气单胞菌溶血素(hemolysin)被认为是该菌重要的毒力因子，绝大多数人源温和气单胞菌有溶血素(hly)的编码基因，目前国内外已有关于人致病性温和气单胞菌溶血素基因的报道 23,而引起水产动物的病原温和气单胞菌尚无相关报道，本项研究用设计的特异性引物进行菌体 PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，分离菌可扩增出大小约1470bp的特异性扩增条带，为病原温和气单胞菌毒力因子的深入研究提供基础研究资料。参考文献: 1 李槿年，余为一
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