有关物质方法学.doc

1、有关物质方法学研究 主要内容1、有关物质检查方法建立的研发思路 2、有关物质方法的建立和方法学验证 2.1、原料药和制剂的相关理化性质 2.2、有关物质分析方法的选择 2.3、有关物质分析方法的验证 2.4、有关物质杂质的定量方法 3、有关物质杂质的分析 4、有关物质杂质限度的制订 有关物质检查方法建立的研发思路 研发思路：有关物质检测方法的建立重点是测定方法的先进性、准确性、可行性。 首先有关物质的方法选择，对于仿制药有 EP、BP、USP 等质量标准的药品，首选以上的色谱条件进行筛选，尤其关注的离子对试剂的使用。 选用不同色谱条件进行对比研究，如果方法一是等度测定的，方法二最好选用梯度色谱

2、条件，比较两种方法测定结果的杂质个数及杂质含量等。确证有关物质测定方法的准确性。 对所筛选的方法进行系统的方法学研究，比较不同检测方法的优劣，选择较好的色谱条件作为本品有关物质检查的测定方法。 对于仿制药同时要将自制样品与市售原研样品进行全面的质量比较，分析其杂质的种类和含量，确保自制样品与市售原研样品的杂质在同一水平。 原料药和制剂的相关理化性质 在建立有关物质检查方法前，需首先了解原料药和制剂的相关理化性质。 对于原料药，了解原料药的基本性质和结构特点。了解原料药合成工艺过程中的起始原料、副产物、副产物产生的杂质、中间产物或可能产生的降解产物等。结合相关已知的杂质来确定有关物质检测的条件。

3、 对于制剂，可能影响药物有关物质的重要因素有辅料、剂型、存储条件等，主要了解辅料对有关物质检测的干扰情况，不同剂型在不同存贮条件下可能产生的杂质等。对于复方制剂，同时要考虑到复方中原料的相互作用可能产生的杂质等。 有关物质分析方法的选择 有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法。通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。目前普遍采用的杂质检测方法主要有： 高效液相色谱法（HPLC） 目前采用的分析方法主要以高效液相色谱法为主，为常用的分析方法。选择不同的色谱柱对杂质进行有效的分离。 薄层色谱法(TLC) 是色

4、谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，但准确性较低。 气相色谱法(GC) 气相色谱法主要是用于能气化的物质的检测和分离。一般用于有机残留溶剂的检测和分离。也可用于一些能挥发的杂质的检测。 毛细管电泳法（CE） 毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的淌度和（或）分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。其应用比较广泛，但该方法测定精密度不高，专属性不稳定，且 CE 仪器价格较高。 由于各种分析方法均具有一定的局限性，因此在进行杂质分析时，应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证，如 HPLC 与 TLC 及 HPLC

5、 与 CE 的互相补充，反相HPLC 系统与正相 HPLC 系统的相互补充，HPLC 不同检测器检测结果的相互补充等。 有关物质分析方法的验证 检测波长的选择 有关物质检测波长是结合主成分与杂质的最大吸收波长进行选择。 测定方法：分别称取待测供试品、对照品、空白辅料、市售对照样品适量，用流动相溶解并稀释到一定浓度，配制成对照品溶液、供试品溶液以及空白辅料溶液，分别于采用 HPLC 法测定，采用 DAD 检测器进行，确定待测物质中各杂质的最大吸收波长、主峰的最大吸收波长以及空白辅料的干扰情况等，有杂质对照品的同时进行扫描，或HPLC 进行测定。必要时可将供试品溶液适当破坏后测定各降解产物的最大吸

6、收波长。 判断结果：根据测定结果确定有关物质测定的检测波长。 有关物质分析方法的验证 专属性试验 专属性系指在其它成分可能共存的情况下，采用的方法能准确测定出被测杂质的特性 对于原料药，可根据其合成工艺，采用各步反应的中间体（尤其是后几步反应的中间体） 、立体异构体、粗品、重结晶母液等作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求，从而验证分析方法对工艺杂质的分离能力。 根据药物的化学结构特点、制剂的处方与工艺、储存条件等选用合适的酸、碱、光、热、湿、氧化反应等加速破坏性试验来验证分析方法的专属性。 强制降解试验在试验过程中，应注意破坏性试验要适度，应着重

7、考察敏感条件。如在一定条件下稳定，则无必要再提高条件的剧烈程度进行重复试验。破坏试验的程度暂无统一要求，一般以强力破坏后主成分的含量仍占绝大部分为宜。要达到这种破坏程度，需要在研究过程中进行摸索，先通过初步试验了解样品对光、热、湿、酸、碱、氧化条件的基本稳定情况，然后进一步调整破坏性试验条件（如光照强度、酸碱浓度、破坏的时间、温度等） ，以得到能充分反映降解产物与主成分分离的结果和图谱。 有关物质分析方法的验证 检测限与定量限 检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，是反映分析方法灵敏度的一个重要指标；最低检测限不得大于该杂质的报告限度，以保证检出需控制的杂质。 测定方法：取待测物质对

8、照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为 3：1 时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。同时将信噪比为3：1 的样品溶液进样 6 针，以峰面积计算相对标准偏差。 判断结果：最小检测限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应20%，以最小检测限来确定供试品溶液配制的浓度作为依据。 定量限是指被测杂质能够被定量测定的最低量。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。 测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为 10：1 时相应的浓度或注入仪器的量确定检

9、测限。同时将信噪比为 10：1 的样品溶液进样 6 针，以峰面积计算相对标准偏差。 判断结果：定量限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应10%。 有关物质分析方法的验证 系统适应性 系统适应性试验主要是考察主成分与杂质的分离情况以及主峰参数信息,如理论塔板数、拖尾因子、分离度等，均应符合测定要求。 精密度试验 精密度试验包括：重复性试验、中间精密度试验等。 溶液稳定性试验 考察样品在配制溶剂中的杂质与主峰的稳定性，取一定浓度的样品溶液，分别于不同时间取样测定杂质与主峰的峰面积，以相对标准偏差来表示不同时间测定结果的稳定性。判断结果：结果 RSD,%2.0%，在测定时间内的样品溶液稳定性良好。 耐用

10、性试验 耐用性试验是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。一般系统变化条件：分别考察流动相比例变化5、流动相 pH 值变化0.2 、柱温变化5、检测波长变化5nm、流速相对值变化20 以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于 2.0%，杂质含量的绝对值在 0.1以内。特殊样品如果色谱条件变化比较敏感的，可适当降低变化范围。 耐用性试验部分还包括样品萃取（提取）稳健性：可理解为提取方法的重复性良好。即

11、提取方法的确定验证试验。 有关物质杂质的定量方法 有关物质杂质的定量方法根据杂质与主成分的最大吸收波长及校正因子来确定。若杂质与主峰的吸收波长基本一致，则一般采用自身对照法或峰面积归一化法；若杂质与主峰的吸收波长差异范围较小，校正因子在 0.91.1 之间，则可采用不加校正因子的主成分自身对照法；超出该范围，校正因子在 0.25.0 范围以内时，采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正；若杂质与主峰的吸收波长相差较大，校正因子在 0.25.0 范围以外时，不能通过校正因子校正，则要采用外标法进行测定。 外标法（杂质对照品法） 外标法定量比较准确，采用外标法进行测定时，应进行相应的方

12、法学研究。 A 检测波长的选择 检测波长的选择测定方法参照紫外-可见分光光度法（中国药典2010 版二部附录A）进行测定，或采用 HPLC 法，DAD 检测器进行测定。同时考察辅料干扰等。 B 标准曲线 线性关系应在设计的测定范围内测定。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度系列进行测定，至少制备 5 个浓度。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。 有关物质杂质的定量方法 C 精密度试验 仪器精密度试验主要是考察测定方法在所用的试验仪器测定结果的偏差，精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。 测定方法：取一定浓度的杂质

13、对照品溶液，连续测定次数至少 6 次，以峰面积的测定结果计算相对标准偏差，考察仪器测定的。 D 重复性试验 重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。重复性测定可在规定范围内，至少用 9 次测定结果进行评价，如制备 3 个不同浓度的试样，各测定 3 次，或 100的浓度水平，用至少测定6 次的结果进行评价。常用的测定方法时采用 100%的浓度，测定 6 次，计算测定结果的相对标准偏差。 测定方法:按含量测定的方法，分别平行称取 6 份样品，按外标法测定杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差。 E 中间精密度 中间精密度系指在同一实验室，由于实验

14、室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度。验证设计方案中的变动因素一般为日期、分析人员、设备。考察在不同因素变动的条件下，测定结果的标准偏差。 有关物质杂质的定量方法 测定方法：按含量测定的方法，分别由不同的人员、时间、不同仪器按外标法测定样品杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差。 F 回收率试验 回收率试验来验证测定方法的准确度。试验设计需考虑在规定范围内，制备 3 个不同浓度的试样，各测定 3 次，即测定 9 次，报告已知加入量的回收率（）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。并考察不同浓度下测定结果的相对标准偏差。 测定方法：按含量测定的方法，按加样回收率

15、测定方法，在已知杂质含量的样品中加入不同浓度的杂质对照品，按外标法分别测定不同浓度样品中的测的量，计算测的量比加入量的百分含量（即回收率） ，以不同浓度下的回收率计算相对标准偏差。 G 杂质的检测限 检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，是反映分析方法灵敏度的一个重要指标；最低检测限不得大于该杂质的报告限度，以保证检出需控制的杂质。 测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为 3：1 时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。同时将信噪比为3：1 的样品溶液进样 6 针，以峰面积计算相对标准偏差。 判断结果：最小检测限浓度下样品峰面积的相

16、对标准偏差应20%，以最小检测限来确定供试品溶液配制的浓度作为依据。 有关物质杂质的定量方法 H 杂质的定量限 定量限是指被测杂质能够被定量测定的最低量。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。 测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为 10：1 时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。同时将信噪比为 10：1 的样品溶液进样 6 针，以峰面积计算相对标准偏差。 判断结果：定量限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应10%。 有关物质杂质的定量方法 加校正因子的主成分自身对

17、照法 采用加校正因子自身对照法应进行相应杂质的校正因子的测定，仅适用于已知杂质的控制，如果校正因子在 0.25.0 的范围内也可用加校正因子的主成分自身对照法。 校正因子的定义及特点 一般来讲，HPLC 定量测定中，物质的检测量 W 与色谱响应值（峰面积等）A 之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量） ；而某物质 i 与所选定的参照物质 s 的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围内。 校

18、正因子测定的要求 A 测定校正因子的各杂质与主成分的标准物质（对照品） ，应符合标准物质（对照品）的要求。B 确定校正因子的分析方法应与最终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因子的影响，必要时重新确定。C 要关注影响待测物 UV 吸收的各种因素，如溶液制备所用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分 UV 曲线的峰或谷处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。 有关物质杂质的定量方法 校正因子的测定：A 单浓度点测定：制备适当浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液，分别进样测定，待测样品

19、的绝对校正因子与参照样品绝对校正因子的比，得到校正因子。 B 多浓度点测定：制备适当的高、中、低三水平浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液（涵盖定量限、标准限度） ，分别进样测定，同法进行分别各点计算，求平均值，计算 RSD，得到校正因子。C 标准曲线法测定：精密称取杂质对照品和主成分对照品，分别制备系列溶液（涵盖定量限、标准限度） ，分别进样后，按最小二乘法以进样量对响应值（峰面积等）进行线性回归，求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。D 吸收系数比值法：对于 UV 检测器来讲，两物质的相对校正因子实际上也是两物质以流动相为溶剂，在检测波长处的紫外吸收系数 E1cm1%之比，故

20、可按吸收系数法测定法的相关技术要求测定各自吸收系数，如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸收度介于 0.30.8 之间、至少 5 台不同型号的 UV 分光光度计、2 份供试液同时平行制备测定、同台仪器 2 份供试液的平行测定结果不超过0.5% 等。测定两物质的吸收系数后，经统计分析确定两物质吸收系数，计算比值，求得校正因子。 有关物质杂质的定量方法 测定方法的选择：上述各方法中，A 和 B 法较为简捷，可以快捷地量化特定杂质与主成分紫外吸收特征的差异，多用于评估采用主成分自身对照法定量杂质时是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身对照法定量杂质，需将标准物质赋值信息转化为校正因子

21、固化在质量标准中，那么校正因子的准确性非常关键，校正因子的准确计算应符合更为严格的要求，需要考虑并控制求算校正因子过程中的各种误差因素，以及仪器通用性和色谱系统的耐用性等因素，以便使求得的常数更为准确并具代表性，此时采用 C、D 法更为适宜，如能考虑到测定人员、不同试验室因素的影响，会更加符合常数求算的基本要求。 在采用校正因子测定杂质的时候，要有加校正因子定量方式的合理性和测定结果的准确性的试验对比研究数据（研究数据应包括杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法对相同多批样品杂质定量测定结果的对比数据，作为是否需要校正或能否有效校正检测结果的支持与依据）

22、 。 有关物质杂质的定量方法 不加校正因子的主成分自身对照法（自身对照法） 不加校正因子的主成分自身对照法（自身对照法）是杂质与主成分的响应因子基本相同（校正因子在 0.91.1） 。一般情况下，如杂质与主成分的分子结构相似，其响应因子差别不会太大。 测定方法：称取供试品样品适量，加适当溶剂配制成一定浓度的供试品溶液；精密量取供试品溶液稀释到一定浓度，一般 1%或 2%，作为对照溶液；量取供试品溶液中的杂质峰面积与对照溶液峰面积相比乘以稀释浓度即为供试品溶液中的杂质的含量。 峰面积归一化法 峰面积归一化法测定有关物质简便快捷，但因各杂质与主成分响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线

23、性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素，所以在质量标准中一般不采用峰面积归一化法计算有关物质。 有关物质杂质的分析有关物质杂质的分析主要是对样品中各杂质含量、数量，以及各杂质的来源，有关物质的杂质研究要在整个质量研究过程中，对于杂质含量超过 0.1%的未知杂质要确定其结构，毒性等基本信息；对已知杂质与新增加的杂质均要分别控制，确定杂质的变化情况，同时结合 CTD 的要求，杂质分析部分对于杂质的名称、结构、来源、控制限度、是否定入质量标准等都有明确的要求。 有关物质杂质限度的制订 有关物质杂质限度的制订，首先应从安全性方面进行考虑，尤其对于有药理活性或毒性的杂质，设定的杂质限度不能高于安全性数据所能支持的水平；其次在确保产品安全的前提下，杂质限度的确定主要基于中试规模以上产品的实测情况，应考虑生产的可行性及批与批之间的正常波动；考虑药品本身的稳定性及生产情况的误差，往往对限度做适当放宽。同时对于仿制药还应考虑原研样品的杂质的限度，自制样品应与原研样品的杂质在同一水平，如仍不能达到要求，则应做必要的安全性研究。 有关物质方法学的研究是根据不同样品的不同性质，不同要求进行的，没有固定的格式和固定的内容，但基本的方向是一致的。 在此基础上不断的完善和改进。使测定药物有关物质的方法更准确，更先进，更有专属性。