1、金开瑞客户应用凝胶电泳迁移率技术文章分享一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 客户文章分享：在假单胞菌 pf- 5 中 Hfq 对 lipA 表达的调控作 用题目：The role of Hfq in regulation oflipA expression in Pseudomonasprotegens Pf-5 期刊：Scientific Reports 影响因子：4.259 合作技术： EMSA 研究背景 脂肪酶是一种重要的工业酶，它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于 微生物。目前，脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物 能源工业。然而，传统发
2、酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为 了解决这些问题，有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。 假单胞菌脂肪酶是一种被研究的较清楚的脂肪酶。 然而很少有针对脂肪酶表达调控的机制进 行研究。Hfq 是一种广泛调控蛋白，能够影响细菌生存的各种生理过程，控制多种基因的表 达，调节细菌的蠕动，参与细菌群感应系统的管理。在本研究中，通过敲除或过表达 hfq 和 rsmY 基因，研究 Hfq 对脂肪酶表达的调控。研究发现，Hfq 在转录水平和翻译水平调节 脂肪酶的表达， 主要表现在转录水平的调控。 同时 Hfq 还调控 rsmY 的表达及维持 rsmY 的稳 定性。 将 Hfq
3、 / rsmY 双基因敲除， 发现 hfq 可以直接结合 rsmY 来调控脂肪酶的激活。 总之， 这项研究表明在假单胞菌 pf - 5 中，Hfq 通过在转录水平上调控 rsmY 的表达来影响脂肪酶 的表达。 研究内容及结果 为了研究 Hfq 和 lipA 之间的关系，本文先通过同源重组的方法敲除及突变 hfq 基因，得到 四个基因的突变株。并通过 PCR 的方法检测基因敲降成功。将 hfq 突变后检测了 Pf-5 的生 长、 脂肪酶的表达及活性， 同时检测了 -半乳糖苷酶的活性。 实验结果显示 hfq 被突变后， 单胞菌 Pf-5 生长水平受到抑制， 脂肪酶转录水平表达受到抑制， 同时脂肪酶
4、活性显著降低， -半乳糖苷酶的活性也显著降低。一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 图 1hfq 突变对脂肪酶表达的影响在野生型假单胞菌 pf- 5 中，通过同源重组的方法过表达 hfq，恢复了 hfq 突变体中脂肪酶 的相对活性，结果表明 hfq 基因敲除在启动子水平上影响脂肪酶表达以及活性。此外，在 hfq 突变型中过表达 hfq 后检测脂肪酶和 -半乳糖苷酶的活性，结果显示与野生型相比， 这两种酶的活性都恢复了。这些结果说明 hfq 在转录水平和翻译水平参与 lipA 的表达以及 脂肪酶表达的调控。一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 图 2 hfq 突变对脂肪酶表达的影响 将 phrs、r
5、smA，rsmE、remY、rsmZ 的启动子构建到 lacZ 报告基因的启动子区域，转染进 hfq 敲降后的假单胞菌，检测 -半乳糖苷酶活性。结果显示，转染 phrs、rsmA，rsmE 重组 质粒后 -半乳糖苷酶的活性没有变化，rsmZ 的活性发生了轻微的变化，而 rsmY 的活性变 化很明显。这些结果表明 hfq 可能通过 remY 或 rsmZ 影响 lipA 的表达。一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 图 3 hfq 对调控几种 RNA 活性的影响 使用纯化后的 hfq 蛋白，通过 EMSA 实验进一步研究 hfq 与 rsmY 是否结合。EMSA 实验结果 显示 hfq 不能与
6、rsmA、rsmE 、rsmZ 的启动子序列结合，但是可以与 rsmY 结合。竞争性 EMSA 实验结果显示，随着非标记 rsmY 探针浓度增加，与 hfq 蛋白结合的标记探针越来越少，这 个结果说明 hfq 蛋白可以与 rsmY 结合。图 4 hfq 蛋白纯化及 EMSA 实验 据报道， Hfq 和 rsmY 的结合可以维持 rsmY 的稳定。 然而， 在 pf - 5 中， Hfq 没有被研究过。 因此本文先研究了利福平处理后，pf-5 野生型和 hfq 突变株中 rsmY 的稳定性变化。结果表 明， 与野生型相比， hfq 突变体中 rsmY 的稳定性明显降低。 这个结果显示 Hfq 通
7、过调节 rsmY 的稳定性来影响表达 rsmY，进而影响脂肪酶的表达。一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 图 5 Hfq 对 RsmY 稳定性的影响 通过 PCR 确定 rsmY 基因被敲除后(图 6A)，对脂肪酶表达进行了测定，验证了 rsmY 在调节 脂肪酶表达中的作用。实验结果 hfq 被敲除的细胞中脂肪酶表达量减少。hfq 和 rsmY 都被 敲除的细胞内，脂肪酶表达量显著下调(图 6B 和 C)。此外，在 hfq 突变体中，将 rsmY 恢复 表达，结果显示脂肪酶的表达水平与野生型表达水平相似。在野生型和 hfq 突变型菌株中， 过表达 rsmY 后 lipA 的表达水平都显著上调。
8、一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 图 6 rsmY 对 hfq 调控 lipA 表达的影响文章小结 1. Hfq 基因被敲降后，pf-5 菌株中脂肪酶的表达量显著下调，同时细菌生长受到抑制，说 明 hfq 调控 lipA 的表达和脂肪酶的活性。 2. hfq 可能通过 remY 或 rsmZ 影响 lipA 的表达。 3. EMSA 实验表明 hfq 蛋白可以与 rsmY 结合。 4. Hfq 通过调节 rsmY 的稳定性来影响表达 rsmY，进而影响脂肪酶的表达。 5. Hfq 通过在转录水平上调控 rsmY 的表达来影响脂肪酶的表达。 解析文献 Wu Liu, Menggang Li,
9、et al. The role of Hfq in regulation oflipA expression in Pseudomonasprotegens Pf-5. Scientific. Reports. 7 (1) :10356(2017). 参考文献 1. Houde, A., Kademi, A. Leblanc, D. Lipases and their industrial applications: an overview. Appl. Biochem. Biotechnol. 118, 15570(2004). 2. Soberon-Chavez, G. Palmeros,
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