酶标抗体技术.doc

1、酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和 -半乳糖苷酶等。（ 一 ） 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 抗 体 制 备 技 术辣 根 过 氧 化 物 酶 （ horseradish peroxidase， HRP） 广 泛 分 布 于 植 物 中 ，因 辣 根 中 含 量 最 高 而 得 名 ， 由 无 色 酶 蛋 白 和 深 棕 色 铁 卟 啉 （ 辅 基 ） 构 成 一 种糖 蛋 白 （ 含 糖 18%） 。 此 酶 溶 于 水 和 5

2、0%饱 和 度 以 下 的 硫 酸 铵 溶 液 。 HRP 分 子 量 较 小 （ 40kDa） ， 标 记 物 容 易 穿 透 入 细 胞 内 部 ； 作 用 底 物 为H2O2， 以 二 氨 基 联 苯 胺 （ DAB） 为 供 氢 体 的 反 应 产 物 为 不 溶 性 的 棕 色 吩 嗪 衍生 物 ， 可 用 普 通 光 镜 观 察 ； 在 pH3.5 12 范 围 内 稳 定 ， 对 热 及 有 机 溶 剂 的作 用 亦 较 稳 定 ， 能 耐 受 63 加 热 15min； 用 甲 苯 与 石 腊 包 埋 切 片 处 理 或 用纯 乙 醇 及 10%甲 醛 水 溶 液 固 定 作

3、冰 切 片 均 不 影 响 其 活 性 ； 溶 解 性 好 ， 100mL缓 冲 盐 溶 液 中 可 溶 解 5gHRP， 并 可 溶 解 于 62%饱 和 度 以 下 的 硫 酸 铵 溶 液 中 ，故 常 用 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 法 分 离 纯 化 ； 氰 化 物 、 硫 化 物 、 氟 化 物 、 及 叠 氮 化 物等 对 HRP 的 活 性 有 抑 制 作 用 ， 应 避 免 使 用 NaN3 作 为 酶 标 试 剂 的 防 腐 剂 ， 以防 止 失 活 。 凡 能 在 HRP 和 H2O2 存 在 时 被 酶 催 化 H2O2 反 应 而 和 成 有 色 产 物 的 化 合物

4、（ 供 氢 体 ） 都 可 以 用 显 色 剂 。 供 氢 体 的 产 物 分 不 溶 性 和 可 溶 性 两 类 。 前 者最 常 用 的 为 3， 3二 氨 基 联 苯 胺 (3,3diaminobenzidine,DAB)， 适 用 于免 疫 组 化 法 ； 反 应 后 的 氧 化 型 中 间 体 迅 速 聚 合 ， 形 成 不 溶 性 棕 色 吩 嗪 衍 生 物 ；这 种 多 聚 物 还 能 还 原 和 螯 合 四 氧 化 饿 ， 形 成 具 有 电 子 密 度 的 产 物 ， 适 用 电 镜检 查 ； 此 外 还 有 饱 和 联 苯 胺 溶 液 ， 氧 化 后 产 物 呈 黄 褐 色

5、 ， 多 用 于 酶 免 疫 扩 散的 深 沉 线 显 色 。 后 者 最 常 用 的 为 邻 苯 二 胺 (O-phenylene diamine,OPD)， 产物 橙 色 ， 可 溶 性 、 敏 感 性 高 ， 最 大 吸 收 值 为 490nm， 可 用 肉 眼 判 别 ； 易 被 浓酸 终 止 反 应 ， 颜 色 可 数 小 时 不 变 ， 是 ELISA 中 最 常 用 的 一 种 ； 但 对 光 敏 感 ，使 用 时 要 避 光 ， 并 发 现 有 致 癌 作 用 。 用 HRP 标 记 抗 体 需 借 助 交 联 剂 的 作 用 ， 将 酶 连 接 在 抗 体 分 子 上 。 常

6、 用 的交 联 剂 为 过 碘 酸 钠 和 戊 二 醛 (glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。 1、 改 良 过 碘 酸 钠 法HRP 分 子 中 与 酶 活 性 无 关 的 糖 基 被 过 碘 酸 钠 氧 化 为 醛 基 ， 再 与 抗 体 蛋 白的 氨 基 形 成 schiff 碱 。 为 了 防 止 酶 蛋 白 的 氨 基 与 醛 基 反 应 发 生 自 身 偶 联 ，在 标 记 前 先 用 2， 4-二 硝 基 氟 苯 （ DNFB） 封 闭 酶 蛋 白 中 残 存 的 -和 -氨基 。 酶 与 抗 体 的 结 合 反 应 后 ， 再 加 入 硼 氢 化 钠

7、(NaHB4） 还 原 成 稳 定 的 结 合物 。 标 记 步 骤 （ 1） 取 5mg HRP 溶 于 0.5mL 蒸 馏 水 ， 加 入 1%2， 4 而 二 硝 基 氟 苯（ DNFB） 无 水 乙 醇 溶 液 0.1mL， 室 温 （ 20 ） 下 轻 微 搅 拌 作 用 1h。 （ 2） 加 入 1mL 0.06mol/L NaIO4， 室 温 下 避 光 轻 搅 30min， 溶 液 呈 黄绿 色 。 （ 3） 加 入 1mL0.16mol/L 乙 二 醇 ， 室 温 （ 20 ） 下 轻 搅 作 用 1 h，终 止 氧 化 反 应 。 （ 4） 加 入 5mg 抗 体 （ Ig

8、） ， 装 入 透 析 袋 ， 置 0.05mol/L， pH9.6 碳 酸盐 缓 冲 液 （ 无 水 碳 酸 钠 1.5g， 碳 酸 氢 钠 2.93g,蒸 馏 水 加 至 1 000 mL） 1 000 mL 中 ， 4 透 析 过 夜 ， 更 换 3 次 。 （ 5） 取 出 透 析 袋 中 液 体 （ 约 3 mL） ， 加 入 5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4 2h 或 过 夜 。 （ 6） 加 50%饱 和 硫 酸 铵 （ NH4） 2SO4 溶 液 （ 硫 酸 铵 850g， 蒸 馏 水 加 至1 000 mL， 以 30%氨 水 调 pH7.2） 6 mL 沉 淀 结

9、合 物 ， 置 4 30min 后 ， 3 000r/min 离 心 30min， 取 深 沉 （ SPA 不 需 要 进 行 此 步 ） 。 （ 7） 将 沉 淀 物 溶 于 PBS（ 0.02M pH7.4） 中 ， 装 入 透 析 袋 ， 并 以 此 缓 冲液 透 析 平 衡 6-12h， 换 液 3 次 。 （ 8） 在 结 合 物 内 加 入 BSA 至 蛋 白 浓 度 为 10mg/ mL， 或 加 等 量 60%甘 油 ，测 定 工 作 效 价 后 ， 小 量 分 装 （ 或 冻 干 ， 不 需 加 甘 油 ） ， 低 温 保 存 备 用 。 2、 戊 二 醛 交 联 法戊 二

10、醛 是 一 种 常 用 的 同 型 双 功 能 交 联 剂 ， 通 过 它 的 两 个 醛 基 分 别 与HRP 和 抗 体 蛋 白 的 氨 基 结 合 ， 形 成 HRP-戊 二 醛 -Ab 蛋 白 结 合 物 。 反 应 可 在4-40 温 度 范 围 ， pH6.0 8.0 的 缓 冲 溶 液 中 进 行 ， 分 为 一 步 法 和 二 步 法 ，戊 二 醛 一 步 法 是 将 酶 和 待 标 记 抗 体 混 合 ， 同 时 加 入 戊 二 醛 进 行 交 联 反 应 。 戊二 醛 二 步 法 是 将 酶 先 与 戊 二 醛 作 用 ， 形 成 酶 -戊 二 醛 结 合 物 ， 结 过

11、透 析 或 层析 除 去 未 结 合 的 戊 二 醛 ， 然 后 再 与 抗 体 结 合 。 标 记 步 骤 （ 1） 取 10mgHRP 溶 于 0.2 mL1.25%戊 二 醛 (用 0.01mol/L、 pH6.8PB将 25%戊 二 醛 稀 释 为 1.25%)， 室 温 （ 20 左 右 ） 反 应 结 合 18h。 （ 2） 用 0.15mol/LNaCl 平 衡 过 的 Sephadex G-50 凝 胶 柱 洗 脱 ， 除 去 游离 的 戊 二 醛 ， 或 用 0.01mol/L， pH7.2PBS， 4 透 析 过 夜 。 （ 3） 将 5mg 抗 体 IgG 溶 于 1mL

12、0.15mol/L NaCl， 再 与 醛 化 HRP 溶 液（ 10mg/mL） 混 合 。 （ 4） 加 入 0.1mL 1mol/L pH9.6 碳 酸 盐 缓 冲 液 （ 调 节 pH 至9.0 9.6） ， 4 ， 电 磁 搅 拌 下 结 合 24h。 （ 5） 加 入 0.1mL0.2mol/L 赖 氨 酸 （ 0.29g 溶 于 10mL 蒸 馏 水 ） ， 4 放置 2h， 以 封 闭 残 留 的 醛 基 ， 终 止 反 应 。 （ 6） 装 入 透 析 袋 ， 以 0.01mol/L、 pH7.2 PBS， 4 透 析 过 夜 ， 或 通 过Sephadex G-200 凝

13、胶 柱 层 析 ， 用 PBS 洗 脱 ， 收 集 第 1 峰 洗 脱 液 ， 加 入 等 量60%甘 油 ， 测 工 作 效 价 后 ， 小 量 分 装 ， 4 或 -20 保 存 。 （ 二 ） 过 氧 化 物 酶简 介抗 过 氧 化 物 复 合 物 制 备 技 术 Stemberger(1970)等 ， 首 先 报 道 了 过 氧 化 物 酶 -抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物（ peroxidase-antiperoxidase,PAP） 法 ， 此 法 也 称 为 非 标 记 抗 体 酶 法（ unlabelled antibody enzymemethod） 。 PAP 法 不

14、需 用 任 何 化 学 交 联 剂 处理 酶 和 抗 体 ， 二 者 活 性 不 受 化 学 反 应 的 影 响 ， 可 大 大 提 高 免 疫 酶 法 的 灵 敏 度 。标 记 步 骤（ 1） 取 5mL 抗 HRP 血 清 ， 16 000r/min 4 离 心 20min， 取 上 清 液 。 （ 2） 加 入 1mL HRP(2mg/mL)溶 液 混 匀 ， 室 温 （ 20 ） 静 置 1h， 16 000r/min， 4 离 心 20min， 取 沉 淀 物 。 （ 3） 加 冷 生 理 盐 水 反 复 洗 涤 -离 心 （ 16 000r/min， 4 离 心 20min） 3次

15、 ， 弃 上 清 ， 取 沉 淀 物 。 （ 4） 加 入 过 量 HRP 溶 液 4mL（ 2mg/mL） 混 匀 后 ， 移 至 小 烧 杯 内 。 （ 5） 在 pH 计 监 控 下 ， 边 搅 拌 边 加 入 0.1 及 0.01mol/L HCl 调 至pH2.4 左 右 ， 使 沉 淀 完 全 溶 解 。 （ 6） 立 即 加 入 0.01mol/LnaOH,调 pH7.4， 16 000r/min， 4 离 心20min， 取 上 清 液 。 （ 7） 加 入 1/10 体 积 的 0.075mol/L 醋 酸 钠 和 0.15mol/L 醋 酸 铵 的 等 量混 合 液 后 混

16、 匀 。 （ 8） 电 磁 搅 拌 下 逐 滴 加 入 等 量 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 ， 并 继 续 搅 拌10min， 4 放 置 20min， 16 000r/min， 4 离 心 20min， 去 上 清 ， 取 深 沉 物 。（ 9） 以 50%饱 和 硫 酸 铵 洗 涤 ， 4 、 16 000r/min20min， 离 心 2 次 ，取 深 沉 物 。 （ 10） 加 5mL 蒸 馏 水 将 深 沉 物 溶 解 后 装 入 透 析 袋 ， 用 Ph6.75 醋 酸 盐 缓冲 液 （ 13.5L 生 理 盐 水 、 1.5L 蒸 馏 水 、 75mL 1.5mol/L 醋 酸

17、钠 及 75mL 粉 酶3moL/L 醋 酸 铵 ） 4 透 析 3d， 每 天 换 液 2 次 。 （ 11） 17 000r/min， 4 离 心 20min， 取 上 清 液 进 行 工 作 效 价 鉴 定 。 （ 12） 加 等 量 60%甘 油 ， 小 量 分 装 ， -20 保 存 。 （ 三 ） McAb-PAP 制 备 技 术用 抗 HRP McAb 制 备 PAP 复 合 物 的 工 艺 条 件 较 为 简 便 ， 而 且 不 需 严 格 的条 件 限 制 。 用 小 鼠 抗 HRP McAb 制 备 的 腹 水 ， 按 一 定 的 HRP/IgG 克 分 子 比 混和 ，

18、置 37 水 浴 反 应 2h， 即 成 鼠 PAP 复 合 物 。 以 按 HRP/IgG 克 分 子 比 为4 1 制 备 为 宜 。 （ 四 ） 碱 性 磷 酸 酶 标 抗 体 制 备 技 术简 介碱 性 磷 酸 酶 （ alkaline phosphatase， AP） ， 系 小 牛 肠 粘 膜 和 大 肠 杆菌 中 提 炼 出 来 的 一 种 磷 酸 酯 的 水 解 酶 ， 由 多 个 同 功 酶 组 成 。 从 小 牛 肠 粘 膜 提取 的 AP 分 子 量 为 100kDa， 酶 作 用 的 最 适 pH 为 9.6； 从 大 肠 杆 菌 中 提 取 酶分 子 量 为 80kD

19、a， 最 适 pH 为 8.0。 它 的 作 用 底 物 较 多 ， 常 用 的 酶 底 物 有 对 硝基 本 磷 酸 盐 （ PNP） 、 -甘 油 磷 酸 钠 、 磷 酸 萘 酯 等 。 AP 主 要 用 作 双 标 记 染色 ， 研 究 递 质 共 存 及 酶 名 疫 测 定 。 AP 标 记 抗 体 ， 一 般 采 用 戊 二 醛 作 交 联 剂一 步 法 ， 使 酶 和 抗 体 蛋 白 的 氨 基 分 别 与 戊 二 醛 的 两 个 醛 基 结 合 。 标 记 步 骤（ 1） 取 抗 体 （ 2 5mg/mL） 1mL， 加 入 AP 5mg 溶 解 。 （ 2） 装 入 透 析 袋

20、 ， 用 0.01mol/L、 Ph7.2PBS4 透 析 18h， 换 液 3 次 。 （ 3） 加 入 2.5%戊 二 醛 20uL， 室 温 （ 20 ） 放 置 2h。 40.01mol/L、 pH7.2PBS 透 析 过 夜 ， 换 液 3 次 。 （ 4） 移 入 0.05mol/L、 pH8.0Tris-HCl 缓 冲 液 中 ， 4 透 析 过 夜 ， 换 液3 次 。 （ 5） 取 出 标 记 抗 体 ， 用 含 %BSA 和 0.02%NaN3 的 Tris-HCl 缓 冲 液 稀 释至 4mL， 即 为 酶 标 记 物 原 液 。 （ 6） 加 入 1/3 量 纯 甘 油

21、 ， 测 定 工 作 效 价 后 ， 小 量 （ 0.1mL） 分 装 ， 4保 存 （ 使 用 前 以 pH7.4PBS-吐 温 溶 液 将 结 合 物 适 当 稀 释 ） 。 （ 五 ） 碱 性 磷 酸 酶-抗 碱 性 磷 酸 酶 复 合 物 制 备 技 术 Mason 等 （ 1978） ， 用 碱 性 磷 酸 酶 代 替 过 氧 化 物 酶 ， 建 立 了 碱 性 磷 酸 酶 -抗 碱 性 磷 酸 酶 复 合 物 （ APAAP） 桥 联 酶 标 技 术 。 但 以 AP 作 为 抗 原 用 常 规 免疫 方 法 制 备 的 抗 血 清 ， 很 难 达 到 APAPP 桥 联 酶 标

22、技 术 的 质 量 要 求 ， 在 一 定程 度 上 限 制 了 此 项 技 术 的 推 广 使 用 。 杨 志 刚 等 （ 1989） 利 用 抗 AP 的 McAb建 立 了 一 种 制 备 APAAP 复 合 物 的 简 便 方 法 。 只 需 将 AP 和 抗 AP 的 McAb 以 适当 比 例 混 合 ， 4 结 合 过 夜 即 可 使 用 。 采 用 改 良 的 ELISA 方 法 检 测 APAAP 复合 中 AP 的 最 适 含 量 。 具 体 方 法 是 ： 用 羊 抗 鼠 Ig 包 被 微 量 滴 定 板 ； 加 入 一定 量 的 抗 APMcAb； 分 别 加 入 不 同 量 的 AP 作 用 后 经 过 洗 涤 ； 加 底 物 显 色 ， 测定 光 密 度 值 （ OD） 。 在 一 定 范 围 内 ， APAAP 复 合 物 溶 液 中 AP 含 量 增 加 的 同时 ， 相 应 的 OD 值 也 随 之 增 大 ； 当 AP 增 加 到 一 定 量 时 （ 约 6 8mg/mL） 、OD 值 保 持 稳 定 。