1、 本文档下载自文库下载网，内容可能不完整，您可以点击以下网址继续阅读或下载：http:/ RP_HPLC 法分离苯乙醇胺类化合物对映体 _杨晶第 26 卷第 1 期2009 年 1 月沈 阳 药 科 大 学 学 报JournalofShenyangPharmaceuticalUniversityVol.26 No.1p.36Jan.2009文章编号:100622858(2009)0120036204柱前衍生化 RP2HPLC 法分离苯乙醇胺类化合物对映体杨 晶,关 瑾11,2,潘 莉,程卯生,李发美331(1.沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳 110016; 2.110124;3.沈阳药科大学,)
2、2 摘要:目的以 2,3,4,6222DTC)为手性衍生化试剂,建立苯乙采用 RP2HPLC 法。考察了衍生化反应中碱,并考察流动相的组成和 pH 值等因。讨论了化合物的分子结构对手性衍生化及衍生后的非对-1映异构体色谱分离的影响。结果在三乙胺和 GITC 的浓度分别为 10 和 5mmol?L 的乙腈溶液中,室温下反应 20min 后,有 5 个苯乙醇胺化合物转化成相应的非对映异构体的硫脲衍生物。在-1色谱条件为:DiamonsilC18 色谱柱(150mm4.6mm,5m),30mmol?L 醋酸铵(pH6.0)2 乙腈-1(体积比为 5050)为流动相,检测波长 254nm,流速 1.0
3、mL?min,室温下,5 个苯乙醇胺化合物对映体衍生化后非对映异构体的分离度达到 4 以上。结论该方法可作为苯乙醇胺类化合物对映体分离的方法之一。关键词:反相高效液相色谱法;手性分离;手性衍生化;苯乙醇胺类化合物对映体中图分类号:R917 文献标志码:A苯乙醇胺 肾上腺素受体(222AR)激动剂是 2AR 激动剂的一种,主要用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等引起的气道阻塞性疾病。绝大多数的苯乙醇胺类 2AR 激动剂分子中具有手性中心,存在光学异构体,通常左旋苯乙醇胺 2AR 激动剂药理活http:/ 性高于右旋体1。建立此类化合物的手性分离方法对深入研究其对映体的药效、药理作用具有重要
4、意义。目前对苯乙醇胺类 2AR 激动剂的手性分离方法多采用高效液相手性固定相法2-4体,分离度均达到 4 以上。讨论了化合物的结构与衍生化反应及手性分离的关系,进一步扩展了 GITC 的应用。方法简单、操作方便,可以用于对映体的质量控制及立体选择性药物代谢动力学的研究。与价格昂贵的手性固定相法相比,大大降低了分析成本,为苯乙醇胺类化合物的手性分离提供了一个有力工具。1 仪器与材料JASCOPU2980 高效液相色谱系统(日本 Jas2co 公司),ANASTRA 色谱工作站(美国SuntekScience 公司)。,尚未有采用手性衍生化法分2 离此类化合物的报道。2,3,4,62 四 2O2
5、乙酰基 2D2 葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)是应用广泛的衍生 2 化试剂之一,常作为氨基酸、氨基醇等类化合物的衍生化试剂5-8。作者首次采用 GITC 柱前衍生化法,将苯乙醇胺类化合物 18(化学结构式见图 1)对映体转化为非对映异构体后,采用RP2HPLC 法在 DiamonsilC18 色谱柱上进行分离。成功地分离了克伦普罗(7)等 5 对苯乙醇胺对映苯乙醇胺类化合物 18(实验室自制,纯度2 质量分数99%),2,3,4,62 四 2O2 乙酰基 2D2 葡萄糖异硫氰酸酯(GITC,美国 Sigma 公司),甲醇、乙腈(色谱纯,天津市康科德科技有限公司),醋酸铵、磷酸二氢钾、三乙胺(分析
6、纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司),水(重蒸水,实验室自制)。收稿日期:2008204209作者简介:杨晶(19812),女(汉族),黑龙江哈尔滨人,博士研究生,E;李发美http:/ 1 期杨 晶等:柱前衍生化 RP2HPLC 法分离苯乙醇胺类化合物对映体F aminecompounds1-82 2.1 色谱条件冰箱放置 3 周稳定)100L,并加入 10mmol?L三乙胺的乙腈溶液 100L,盖紧试管塞,涡旋混合 1min,室温放置反应 20min,取 10L 进样,记录色谱图。2.3 衍生化条件考察GITC 是一种非常活泼的异硫氰酸酯类衍生化试剂,在室温下即可与氨基发生反应,得到稳定的
7、非对映异构的硫脲衍生物。作者研究的化合物结构中由于苯环上的氨基电子云密度降低,只有脂肪侧链上的NH与 GITC 进行 11 的化学反应。以克伦普罗(7)为例,与 GITC 的衍生化反应见图 2。-1色谱柱:DiamonsilC18 柱(150mm4.6mm,-15m);流动相:30mmol?L 醋酸铵(pH6.0)2 乙腈(体积比为 5050);检测波长:254nm;柱温:室温;流速:1.0mL?min;进样量:10L。2.2 衍生化条件称取苯乙醇胺类对映体混合物样品适量溶于乙腈中,配制成 1mmol?L 的样品溶液。取-11mmol?L 的样品溶液 100L 置于 10mL 具塞-1试管中,
8、加入 5mmol?LGITC 的乙腈溶液(4-1-1Fig.2 DerivatizationreactionofclenproperolandGITC2.3.1 三乙胺的浓度对衍生化反应的影响实验所用化合物均以其盐酸盐的形式存在,而化合物与 GITC 的衍生化反应属于亲核反应,化合物的盐酸盐与 GITC 无法http:/ 直接进行反应,故须在碱性条件下反应,此时胺上的 N 孤对电子以游离形式存在,有利于亲核反应的进行。实验采用三乙胺(TEA)为碱化试剂,用以中和盐酸并为衍生化反应提供碱性环境,从而省去了将化合物的盐酸盐处理为游离碱的繁琐步骤。实验中考察-1了 TEA 浓度在 130mmol?L
9、 内时,对各对苯乙醇胺化合物衍生化的影响。随着 TEA 浓度的增大,各反应产物的峰面积(衍生化产率)逐渐增-1大,在 TEA 的浓度大于 10mmol?L 后几乎保持不变。而在高的 TEA 浓度下,有一定的杂质峰出现。所以选择 TEA 的浓度为 10mmol?L 的条件下进行衍生化反应。2.3.2 GITC 的浓度、反应时间对衍生化的影响实验考察了 GITC 的浓度在 120mmol?L 内,对各衍生化反应的影响。结果发现,当 GITC 浓度过低时,仍可在色谱图上观测到未反应的苯乙醇胺化合物,GITC 浓度的增大有利于衍生化反-1应的进行;当 GITC 的浓度增大到 5mmol?L 时,各衍生
10、化反应几近完全,更高的 GITC 浓度不再增大衍生化产物的峰面积。GITC 与苯乙醇胺类化合物在室温下迅速反应,以各化合物衍生后在色谱柱上被洗脱下来的第一个非对映异构体的色谱峰面积为衍生化产率的指标(图 3)对反应结果进行评价。从图 3 可以看出,各化合物的衍生化37-1-1沈 阳 药 科 大 学 学 报第 26 卷 产率随着反应时间的延长而增大,当反应时间达到 20min 时各衍生化产物的峰面积达到最大,更长的反应时间不再增大衍生化产物的峰面积。故选定 GITC 的浓度为 5mmol?L、反应时间为 20min。-12.4.2 有机改性剂的种类和浓度对分离的影响分别选用不同比例的甲醇、乙腈作
11、为有机改性剂,考察有机改性剂的种类和浓度对衍生后非对映异构体分离的影响。实验表明,以甲醇或乙腈为有机改性剂均可以实现衍生物的分离,乙腈更有利于色谱分 http:/ 离,不仅非对映异构体衍生物的分离度较大而且色谱峰峰形对称。乙腈的体积分数在 40%70%内变化时,分离度有所减小,与 GITC 交叉现象。当-1(pH 值为 6.0)和乙腈的体积 5050 时,所有衍生化后的非对映异构体在较短的保留时间下均可达到良好分离(Rs4)。在本实验选定的条件下,经 GITC 柱前衍生化,采用 RP2HPLC 法,在流动相为 30mmol?L 醋酸铵(pH6.0)-乙腈(体积比为 5050)、检测-1波长 2
12、54nm、流速 1.0mL?min、室温下,化合物 14、7 与 GITC 形成非对映异构体,并实现了色谱分离,分离度分别为 5.7、4.9、4.5、4.0、5.2,其-11Compound1;2Croperol;3Compound3;4Compound2;5Compound4Fig.3 Effectofreactiontimeonderivatization2.4 色谱条件考察2.4.1 缓冲液种类、浓度和 pH 值对分离的影响在 DiamonsilC18 色谱柱上,分别考察了不同浓度的醋酸铵和磷酸二氢钾,对衍生后非对映异构体分离的影响。实验结果表明,缓冲盐的加入可以调节色谱峰形,改善峰拖尾
13、,但其种类和浓度对色谱分离影响不大,故选择在水相中添加-130mmol?L 醋酸铵。通常缓冲溶液的 pH 值是影响色谱分离的主要因素,实验考察了缓冲溶液的 pH 值为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 时对各衍生物的分离度的影响。克伦普罗和化合物14 与 GITC 衍生化反应得到的非对映异构体的分离度(RS)随 pH 的变化趋势见图 4,可以发现衍生化后的非对映异构体在不同的 pH 条件下分离度变化不大,最终选择了一个适中的 pH值 6.0 作为最后分离的条件。色谱图见图 5。过量的 GITC 在 9min 左右出峰,衍生化所得的非对映异构体在 10min 后出峰。化合物 5、6 和 8
14、(马布 http:/ 讨论a.GITC 结构中反应基团异硫氰基与空间位阻较大的全乙酰化 2D2 葡萄糖基直接相连,所以 GITC 与底物的空间位阻作用对衍生化反应影响显著。化合物 5 和 6 属于 22 苯基 222 氨基乙醇化合物,结构中氨基与苯环之间只隔有 1个碳原子,所以苯环与 GITC 之间的空间位阻作用阻碍了反应的进行。化合物 14、7、8 属于 12 苯基 222 氨基乙醇化合物,氨基与苯环相隔 2 个碳原子,但在化合物 8 结构中氨基与立体位阻很大的叔丁基直接相连,叔丁基与 GITC 的空间位阻作用导致衍生化反应不能进行;而其他 5 个化合物氨基上的取代基均为位阻小的异丙基和正丁
15、基,与 GITC 的空间位阻作用小,可以顺利发生衍生化反应得到非对映异构体衍生物。b.在选定的色谱条件下,上述 5 对 12 苯基 2221Compound1;2Clenproperol;3Compound2;4Compound3;5Compound4Fig.4 EffectofpHvalueonresolution38氨基乙醇类化合物非对映异构体的分离度均大于 4,且相差不多。可以推测出,GITC 的大分子结构在色谱分离中起到主要作用。GITC 结构中的全乙酰化 2D2 葡萄糖基具有刚性强、亲脂性强的第 1 期杨 晶等:柱前衍生化 RP2HPLC 法分离苯乙醇胺类化合物对映体特点,从而对非对
16、映异构衍生产物的色谱行为差异有直接影响。化,首次建立了苯乙醇胺类化合物对映体的 GITC 柱前衍生化高效液相色谱法。该方法简单易行,为苯乙醇胺类化合物的手性分离提供了一个有力工具。作者成功分离了用在之前建立的Chiral24pakAS2H 手性固定相法无法分离的 5 个化合物,两种分离手性苯乙醇胺类化合物的方法各有特色,并具有一定的互补性。参考文献 1B.tandasthma2100J.EurJPharmahttp:/ )2(182crown26)22,3,11,122tetracarboxylicacid:UnusualtemperatureeffectJ.JChromatogrA,2005
17、,1083(1/2):89-95.3LUXiu2mei,LIUPei,CHENHua2shan,etal.Enantiose2lectivepharmacokineticsofmabuterolinratsstudiedu2singsequentialachiralandchiralHPLCJ.BiomedChromatogr,2005,19(9):703-708.4YANGJing,GUANJin,PANLi,etal.Enantioseparationandimpuritydeterminationoftheenantiomersofnovelphenylethanolaminederiv
18、ativesbyhighperformanceliq2uidchromatographyonamylosestationaryphaseJ.AnalChimActa,2008,610(2):263-267.5NIMURAN,TOYAMAA,KINOSHITAT.Opticalreso2lutionofaminoacidenantiomersbyhigh2performanceliquidchromatographyJ.JChromatogrA,1984,316:547-552.6周晔,孙曾培.用 GITC 手性试剂衍生化高效液相色谱法拆分 2 氨基醇类药物对映体J.药学学报,1990,25(4
19、):311-314.:/ HPLCofofdiastereoisomeroffivephenylethano2laminecompoundsafterderivatization分离分析 12 氮杂双环2,2,2辛 232 基胺对映异构体J.分析化学,2006,34(10):1475-1478.4 结论作者通过对衍生化条件和色谱条件进行优(下转至第 44 页)39沈 阳 药 科 大 学 学 报第 26 卷 Abstract:ObjectiveTodevelopaHPLCmethodforsimultaneousdeterminationofkakkalide,irisolidone,tecto
20、rigenin272O2xylosylglucosideandbiochaninAinflowersofPuerarialobata.MethodsTheHPLCanal2ysiswascarriedoutonaKromasilC18(200mm4.6mm,5m)column,withalinearitygradientof1?eticacidinwater()2methanol2acetonitrile,atthehttp:/ 39 页)Chiralseparationofphenylethanolaminecompoundsbypre2columnderivatizationhighper
21、formanceliq2uidchromatography,PANLi,CHENGMao2sheng,LIFa2mei(1.SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang 110016,China;2.Schttp:/ 110142,China;3.SchoolofPhar2maceuticalEngineering,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang 110016,China)YANGJing,GUANJinAbstract:ObjectiveTodevelopapre2co
22、lumnhighperformanceliquidchromatographicmethodforthesep211,23312arationofsomephenylethanolaminecompoundswith2,3,4,62tetra2O2acetyl2D2glucopyranosylisothiocya2nate(GITC)asderivativeagent.MethodsTheeffectsofconcentrationoftriethylamine(TEA),concentra2tionofGITCandreactiontimeonderivativereactionwerest
23、udied.TheinfluencesofkindsandconcentrationoforganicmodifierandpHvalueofbufferonchiralseparationwerestudied.Thestructuralfactorsaffectingchiralderivatizationandseparationweredisccussd.ResultsTheseparationwasperformedonaDiamonsilC18column(150mm4.6mm,5m)using30mmol?L-1ammoniumacetate(pH6.0)2acetonitrilehttp:/ 文档，专业文献，应用文书，行业论文等文档搜索与文档下载，是您文档写作和查找参考资料的必备网站。文库下载 http:/
