1、1微生物学陈向东第 1 章 绪论三、微生物与我们微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。 细菌数亿/g 土壤，土壤中的细菌总重量估计为： 10034 10 12 吨； 每张纸币带细菌：900 万个； 人体体表及体内存在大量的微生物：皮肤表面：平均 10 万个细菌/平方厘米；口腔：细菌种类超过 500 种；肠道：微生物总量达 100 万亿，粪便干重的 1/3 是细菌，每克粪便的细菌总数为： 1000 亿个； 每个喷嚏的飞沫含 4500-150000 个细菌，重感冒患者为 8500 万；时时刻刻与微生物“共舞”是 祸？是 福？微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！微生物是人类的朋友！
2、微生物是自然界物质循环的关键环节； 体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；帮助消化、提供必需的营养物质、组成生理屏障 微生物可以为我们提供很多有用的物质；有机酸、酶、各种药物、疫苗、面包、奶酪、啤酒、酱油等等 基因工程为代表的现代生物技术；少数微生物也是人类的敌人！鼠疫；天花；艾滋病；疯牛病；埃博拉病毒；可以说，微生物与人类关系的重要性，你怎么强调都不过分，微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。它给人类带来的利益不仅是享受，而且实际上涉及到人类的生存。“在近代科学中，对人类福利最大的一门科学，要算是微生物学了。 ” 日本学者尾形学在“家畜微生物学”
3、（1977）2四、微生物的发现和微生物学的建立与发展（一）微生物的发现 我国 8000 年前就开始出现了曲蘖酿酒； 4000 年前埃及人已学会烘制面包和酿制果酒； 2500 年前发明酿酱、醋，用曲治消化道疾病； 公元六世纪(北魏时期)贾思勰的巨著“齐民要术” ； 公元 2 世纪，张仲景：禁食病死兽类的肉和不清洁食物； 公元前 112 年-212 年间，华佗： “割腐肉以防传染”； 公元九世纪痘浆法、痘衣法预防天花； 1346 年，克里米亚半岛上的法卡城之战(靼坦人- 罗马人 )； 16 世纪，古罗巴医生 G.Fracastoro：疾病是由肉眼看不见的生物(living creatures)引起
4、的； 1641 年，明末医生吴又可也提出“戾气”学说； 1664 年，英国人虎克（Robert Hooke）曾用原始的显微镜对生长在皮革表面及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察。 1676 年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antonyvan leeuwenhoek）首次观察到了细菌。他没有上过大学是一个只会荷兰语的小商人，但却在 1680 年被选为英国皇家学会的会员。列文虎克利用业余时间制造过 400 多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为 50200 倍，（二）微生物学的奠基1.巴斯德 (1) 发现并证实发酵是由微生物引起的；化学家出生的巴斯德涉足微生物学是为了治疗“酒病”和“ 蚕病 ”(2) 彻底否
5、定了“自然发生”学说；著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物，是它们引起有机质的腐败。(3) 免疫学预防接种首次制成狂犬疫苗(4)其他贡献巴斯德消毒法：6065作短时间加热处理，杀死有害微生物2.柯赫（1）微生物学基本操作技术方面的贡献a）细菌纯培养方法的建立土豆切面 营养明胶 营养琼脂（平皿）b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养c）流动蒸汽灭菌d）染色观察和显微摄影（2）对病原细菌的研究作出了突出的贡献：a）具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；b）发现了肺结核病的病原菌；（1905 年获诺贝尔奖）c）证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则著名的柯赫原则
6、31、 在每一相同病例中都出现这种微生物；2 、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会 重复发生；4 、从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。（三）微生物学发展过程中的重大事件（见讲义 P4 表 1-1 微生物学发展中的重大事件） 1890 Von Behring 制备抗毒素治疗白喉和破伤风； 1892 Ivanovsky 提供烟草花叶病毒是由病毒引起的证据； 1928 Griffith 发现细菌转化；对其机理的研究导致 DNA 是遗传物质的确证；外源遗传物质导入各种细胞的基因重组技术的建立； 1929 Flemin
7、g 发现青霉素； 1944 Avery 等证实转化过程中 DNA 是遗传信息的载体； 1953 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋结构； 19701972 Arber、Smith 和 Nathans 发现并提纯了DNA 限制性内切酶 1977 Woese 提出古生菌是不同于细菌和真核生物的特殊类群 Sanger 首次对 f174 噬菌体 DNA 进行了全序列分析； 19821983 Prusiner 发现朊病毒(prion) ； 19831984 Mullis 建立 PCR 技术； 1995 第一个独立生活的细菌(流感嗜血杆菌) 全基团组序列测定完成； 1996 第一个自养生活
8、的古生菌基因组测定完成； 1997 第一个真核生物(啤酒酵母 )基因组测序完成；（四）20 世纪的微生物学十九世纪末到二十世纪中期：微生物学：鉴定病原菌、研究免疫学及其在预防疾病中的作用、寻找化学治疗药物、分析微生物的化学活性。普通生物学：细胞的构造及其在繁殖和发展中的作用、植物和动物的遗传和进化的机制。动、植物 的生命活动规律适用于结构大大简单的微生物？ 肌肉的糖酵解 酵母菌乙醇发酵本质上的同一性4维生素 生长因子相同的化学本质多种辅酶的前体辅酶为细胞代谢所必需（一切生命系统在代谢水平上具有相同的本质）“生物化学的同一性”生化突变 细菌基因水平转移微生物遗传学对动植物起作用的遗传机制同样适用
9、于微生物肺炎双球菌转化实验病毒重组实验 核酸是遗传的物质基础噬菌体感染实验20 世纪 40 年代后，微生物自身的特点使其成为生物学研究的“明星”，微生物学很快与生物学主流汇合，并被推到了整个生命科学发展的前沿，获得了迅速的发展，在生命科学的发展中作出了巨大的贡献。微生物学与生物学发展的主流汇合、交叉，获得了全面、深入的发展（见 P3 图 1-1 微生物学的主要分支学科）（五）微生物学在生命科学发展中的重要地位1微生物是生物学基本理论研究中的理想实验对象，对微生物的研究促进许多重大生物学理论问题的突破 基因和酶关系的阐明及“一个基因一个酶”的假说；1941 年 Beadle 和 Tatum 用粗
10、糙脉胞霉进行的突变实验使基因和酶的关系得以阐明，并提出了“一个基因一个酶”的假说。 遗传的物质基础的阐明； 基因概念的发展；“断裂基因”、 “跳跃基因”、 “重叠基因”的发现，以及基因结构的精细分析、基因组测序等。 遗传密码的破译；60 年代 Nirenberg 等人通过研究大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系及多聚尿苷酶，发现了苯丙氨酸的遗传密码，继而完成了全部密码的破译，为人类从分子水平上研究生命现象开辟了新的途径。 基因表达调控机制的研究；Jacob 等通过研究大肠杆菌诱导酶的形成机制而提出操纵子学说，5阐明了基因表达调控的机制，为分子生物学的形成奠定了基础。 生物大分子合成的中心法则；DNA
11、RNA 蛋白质2对生命科学研究技术的贡献细胞的人工培养；突变体筛选；DNA 重组技术和遗传工程；3微生物与“人类基因组计划”作为模式生物；基因与基因组的功能研究的重要工具;（五)我国微生物学的发展汤飞凡：沙眼病原体的分离和确证陈华癸：根瘤菌固氮作用的研究高尚荫：创建了我国病毒学的基础理论研究和第一个微生物学专业抗生素的总产量已耀居世界首位两步法生产维生素 C 的技术居世界先进水平泉生热孢菌全基因组序列测定（六）21 世纪微生物学展望1微生物自身的特点（共性和特性）将会更加受到关注和利用共性：微生物具有其他生物共有的基本生物学特性：生长、繁殖、代谢、共用一套遗传密码等，甚至其基因组上含有与高等生
12、物同源的基因，充分反映了生物高度的统一性。特性：微生物具有其它生物不具备的生物学特性，例如可在其他生物无法生存的极端环境下生存和繁殖，具有其他生物不具备的代谢途径和功能，反映了微生物极其丰富的多样性。 以微生物为研究材料继续对一些基本生命现象进行研究； 生物进化方面的研究；在微生物基因组上进行的考古 性别分化的意义；基因水平转移-细菌 DNA 的主动分泌与摄取 生物智慧的发展；聪明的黏菌 生命起源的研究； 极端环境的微生物的研究； 微生物产业的开发； 重要致病菌的特点及其防治；微生物自身特性的进一步开发、利用：例如降解性塑料，分解纤维素、生产单细胞蛋白等。借助（利用）微生物特点的基因工程产业：
13、利用微生物生产原本它们不能生产的药6物、疫苗等。微生物具备生命现象的特性和共性，将是 21 世纪进一步解决生物学重大理论问题，如生命起源与进化，物质运动的基本规律等，和实际应用问题，如新的微生物资源的开发利用，能源、粮食等的最理想的材料。（见讲义 P10）2与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的发展学科交叉永远是科学创新的源泉！ 微生物基因组的序列测定和分析； 微生物的快速检定； 微量热技术对生命过程的研究； 计算机技术与微生物学的结合；微生物的特点：个体小、结构简、胃口大、食谱广、繁殖快、易培养、数量大、分布广、种类多、级界宽、变异易、抗性强、休眠长、起源早、发现晚个体小:测量单位：微米或钠米
14、结构简：无细胞结构（病毒） ；单细胞；简单多细胞；胃口大：消耗自身重量 2000 倍食物的时间：大肠杆菌：1 小时人：500 年（按 400 斤/年计算）食谱广：微生物获取营养的方式多种多样，其食谱之广是动植物完全无法相比的！纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、氰化物、各种有机物均可被微生物作为粮食繁殖快：大肠杆菌一个细胞重约 10 12 克，平均 20 分钟繁殖一代24 小时后： 4722366500 万亿个后代，重量达到：4722 吨48 小时后：2.2 10 43 个后代，重量达到 2.2 10 25 吨相当于 4000 个地球的重量！一头 500 kg
15、 的食用公牛，24 小时生产 0.5 kg 蛋白质,而同样重量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜）和氨水为原料，24 小时可以生产 50000 kg 优质蛋白质。易培养：很多细菌都可以非常方便地进行人工培养！数量大：在自然界中（土壤、水体、空气，动植物体内和体表）都生存有大量的微生物！分布广：人迹可到之处，微生物的分布必然很多，而人迹不到的地方，也有大量的微生物存在！7 数十公里的高空（最高为离地 85 公里，须用火箭采样） ； 几千米的地下； 强酸、强碱、高热的极端环境； 常年封冻的冰川；种类多： 微生物的生理代谢类型多； 代谢产物种类多； 微生物的种数“多” ；虽然目前已定种的微生物只有大
16、约 10 万种，远较动植物为少，但一般认为目前为人类所发现的微生物还不到自然界中微生物总数的 1%级界宽：Whittaker 的五界分类系统Woese 三原界分类系统变异易：个体小、结构简、且多与外界环境直接接触繁殖快、 数量多 突变率：10-5 10-10短时间内产生大量的变异后代青霉素的生产：20 单位/ ml（1943）10000 单位/ ml青霉素的用量：最高：10 万单位/天（40 年代）数百万-千万单位/次细菌抗药性的产生：抗（逆）性强：抗热：有的细菌能在 265 个大气压，250 的条件下生长；8自然界中细菌生长的最高温度可以达到 113 ；有些细菌的芽孢，需加热煮沸 8 小时才
17、被杀死；抗寒：有些微生物可以在12 30的低温生长；抗酸碱：细菌能耐受并生长的 pH 范围：pH 0.5 13；耐渗透压：蜜饯、腌制品，饱和盐水（NaCl, 32%)中都有微生物生长；抗压力：有些细菌可在 1400 个大气压下生长；休眠长：世界上最古老的活细菌（芽孢）：2.5 亿年Nature 407, 897 - 900 (2000) 起源早：38 亿年前，生命在海洋中出现26 亿年前，陆地上就可能存在微生物发现晚：300 多年前人们才真正发现微生物的存在微生物的特点：个体小、结构简、胃口大、食谱广、繁殖快、易培养、数量大、分布广、种类多、级界宽、变异易、抗性强、休眠长、起源早、发现晚第 2
18、 章 纯培养和显微技术微生物的基本特点：小！ 在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性； 微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；培养技术在微生物学中具有重要意义！在研究中所使用的微生物培养群体：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物： 只有一种微生物的培养物；通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！微生物的基本特点：小！微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。第一节 微生物
19、的分离和纯培养9从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。一、无菌技术 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物； 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；1、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：试管、瓶子、培养皿等1887 年，R J Petri 发明 Petri dish常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌高温干热灭菌2、接种操作无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行二、用固体培养基分离纯培养液体培养基；培养基： 固体培养基；半固体培养基； 琼脂柯赫（Robert Koch）的助手 W Heese 和他的夫人 Fran Hees
20、e菌落（colony）：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体众多菌落连成一片菌苔（lawn）不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等） ，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（见 P14 图 2-3） 。同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落10二、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：稀释！1、稀释倒平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！2、涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！3、平板划线法4、
21、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧手套箱稀释摇管法三、用液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过 95%）表现为不生长。例如：若同一稀释度的试管中有 95%表现为不生长，则生长的试管中仅含一个细胞的几率为：4.8%；含二个细胞的几率为：0.12%；含三个细胞的几率为：0.002%0.0480.048 + 0.0012 + 0.0002在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为 97.5%1878 年，Lister 分离乳酸链球菌时所使用的微量注射器和酒杯培养装置注射器的最小吸取量：0.00062 毫升四、单细胞（孢子）分离= 0.97511 一般采用显微
22、操作仪，在显微镜下进行； 操作难度与细胞或个体的大小成反比；五、选择培养分离微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化： 抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。（没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。 ） 使待分离的微生物生长“突出” ；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。1. 利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制 高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含 N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；待分离的微生物的生
23、长特征明显不同于其它微生物 牛奶平板：分离蛋白酶产生菌； 颜色反应：分离特定的菌株； 利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化；第二节 显微镜和显微技术几个基本概念：放大 被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！分辨率 能辨别两点之间最小距离的能力反差 被观察物区别于背景的程度与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。一、显微镜的种类及原理1. 普通光学显微镜复式显微镜简单显微镜光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？目镜：10 15 ；物镜： 100 ；总放大倍数 10001500 ；如何实现光学显微镜一般配置的最大放
24、大倍数？其原理？使用油镜，即在 100 物镜和载玻片之间滴加香柏油；分辨率与所用波长成反比！0.5 l12分辨率（最小可分辨距离）= n sin qq 为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离N：玻片与物镜间介质的折射率空气 (n=1.0)、水 (n=1.33)、香柏油 (n=1.52)、玻璃 ( n=1.54)显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质光线在穿过折射率不同的介质时发生折射用浸没油取代空气的作用：介质折射率提高 数值孔径值和分辨率均得到提高浸没油与玻璃的折射率相近很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。光学显微镜物
25、镜的特性物 镜 特 性 搜 索 物 镜 低 倍 镜 高 倍 镜 油 镜 放 大 倍 数 4 10 40-45 90-100 数 值 孔 径 值 0.10 0.25 0.55-0.65 1.25-1.4 焦 距 （ f） 40 mm 16 mm 4 mm 1.8-2.0 mm 工 作 距 离 17-20 mm 4-8 mm 0.5-0.7 mm 0.1 mm 450nm光 源 （ 蓝光 ） 时 的 分 辨 率 2.3 m 0.9 m 0.35 m 0.18 m 13人眼的分辨能力在 0.2 mm 左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000到 1,500。2. 暗视野显微镜普通
26、光学显微镜又称明视野显微镜其照明光线直接进入视野，属透射照明。3. 相差显微镜形成亮背景暗物象的结果4. 荧光显微镜5. 透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，而用透射电镜来观察样品的表面结构？7. 扫描隧道显微镜二、显微观察样品的制备略！第二章思考题：1、为什么说 Koch 等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？2、微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微观察中通过改变样品的反差以改善观察效果的技术及方法。14第 3 章 微生物类群与形态结构古生菌在进化谱系上与真细菌及真核生物
27、相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。第一节 真细菌（Eubacteria ）一、一般形态及细胞结构（一）个体形态和排列球状基本形态 杆状螺旋状1、球状细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。金黄色葡萄球菌淋病奈瑟氏球菌肺炎链球菌2、杆状细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化，一般不作为分类依据。枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）结核分枝杆菌炭疽病的病原菌-炭疽杆菌破伤风梭菌弧菌螺旋菌
28、螺旋体菌15弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。霍乱弧菌寄生性弧菌-蛭弧菌螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异。鞭毛二端生。细胞壁坚韧，菌体较硬。螺旋体菌：菌体柔软，用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。梅毒密螺旋体4、其它形状1）柄杆菌（prosthecate bacteria）细胞上有柄（stalk） 、菌丝（hyphae） 、附器（appendages）等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄。一般生活在淡水中固形物的表面，其异常形态使得菌体的表面积与体积之比增加，能有效地吸收有限的营养物；2）星形细菌（star-shaped
29、 bacteria ）3）方形细菌（square-ahaped bacteria）4）异常形态环境条件的变化：物理、化学因子的刺激 阻碍细胞正常发育培养时间过长 细胞衰老营养缺乏 异常形态自身代谢产物积累过多（二）大小1、范围最小：与无细胞结构的病毒相仿（50 nm ；）最大：肉眼可见（0.75 mm） ；（参见 P 33，最小和最大的细菌）费氏刺骨鱼菌(0.08 mm x 0.6 mm)(Epulopiscium fishelsoni)比大肠杆菌大 100 万倍（1985年发现）德国科学家 H. N. Schulz 等 1999 年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌（sulfur
30、 bacterium） ，其大小可达 0.75 mm，Thiomargarita namibiensis，-“ 纳米比亚硫磺珍珠”最大和最小细菌的个体大小悬殊：（Thiomargarita namibiensis ） （0.75mm）10 亿 100 亿倍（nanobacteria） （50 nm）光学显微镜物镜的特性在对细菌进行光学显微镜观察时，油镜最常使用，也最为重要。一般细菌的大小范围：正常形态 环境条件恢复正常160.5 1 mm （直径）0.2 1 mm （直径） X 1 80 mm（长度）0.3 1 mm （直径） X 1 50 mm（长度）(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长
31、度)2、测量方法显微镜测微尺显微照相后根据放大倍数进行测算（二）大小2、细菌大小测量结果的影响因素 （参见 P 31）个体差异；干燥、固定后的菌体会一般由于脱水而比活菌体缩短 1/3-1/4；染色方法的影响，一般用负染色法观察的菌体较大；幼龄细菌一般比成熟的或老龄的细菌大；环境条件，如培养基中渗透压的改变也会导致细胞大小的变化。（三）细胞的结构（见 P39）一般构造：一般细菌都有的构造特殊构造：部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的构造1、细胞壁1）概念：细胞壁（cell wall）是位于细胞表面，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧，略具弹性的细胞结构。2）证实细胞壁存在的方法：（1）细菌超薄切
32、片的电镜直接观察；（2）质、壁分离与适当的染色，可以在光学显微镜下看到细胞壁；（3）机械法破裂细胞后，分离得到纯的细胞壁；（4）制备原生质体，观察细胞形态的变化；3）细胞壁的功能： （参见 P38）（1）固定细胞外形和提高机械强度；（2）为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需；（3）渗透屏障，阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于 800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；（4）细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基础；174）革兰氏染色与细胞壁： （参见 P46）（1）革兰氏染色简单染色法正染色鉴别染色法死菌负染色： 荚膜染色法等细菌染色
33、法活菌：用美蓝或 TTC（氧化三苯基四氮唑）等作活菌染色（1）革兰氏染色C.Gram（革兰）于 1884 年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色表 3-1 革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁成分的比较（2）革兰氏阳性
34、细菌的细胞壁特点：厚度大（2080nm）化学组分简单，一般只含 90%肽聚糖和 10%磷壁酸。肽聚糖(peptidoglycan)磷壁酸（teichoic acid）又称粘肽(mucopeptide)、胞壁质(murein)或粘质复合物(mucocomplex)，是真细菌细胞壁中的特有成分。结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖A、肽聚糖厚约 2080nm，由 40 层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。革兰氏染色法抗酸性染色法芽孢染色法姬姆萨染色法占 细 胞 壁 干 重 的 % 成 分 革 兰 氏 阳 性 细 菌 革 兰 氏 阴 性 细 菌 肽 聚 糖 含 量 很 高 （ 50
35、90） 含 量 很 低 （ 10） 磷 壁 酸 含 量 较 高 （ 50） 无 类 脂 质 一 般 无 （ 2） 含 量 较 高 （ 20） 蛋 白 质 无 含 量 较 高 革兰氏阳性细菌的细胞壁双糖单位原核生物所特有的已糖18由四个氨基酸分子按 L 型与 D 型交替方式连接而成双糖单位中的 -1,4-糖苷键很容易被溶菌酶(lysozyme)所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。目前所知的肽聚糖已超过 100 种，在这一“肽聚糖的多样性”中，主要的变化发生在肽桥上。B、磷壁酸革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结
36、合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的 10%，有时可接近 50%。用稀酸或稀碱可以提取。跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的膜磷壁酸（又称脂磷壁酸） ，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用 45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。主要生理功能： （参见 P41）细胞壁形成负电荷环境，增强细胞膜对二价阳离子的吸收；二价阳离子，特别是高浓度的 Mg2+。的存在，对于保持膜的硬度，提高细胞膜上需Mg2+的合成酶的活性极为重要。贮藏磷元素；增强某些致病菌对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；革兰氏阳性细菌特异表面抗原的物质基
37、础；噬菌体的特异性吸附受体；能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，防止细胞因自溶而死亡。可作为细菌分类、鉴定的依据19（3）革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖外膜外膜蛋白周质空间A、肽聚糖 （参见 P41）埋藏在外膜层之内，是仅由 12 层肽聚糖网状分子组成的薄层(23nm)，含量约占细胞壁总重的 10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)（只在原核微生物细胞壁上发现）没有特殊的肽桥，只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套B、外膜(outer membrane) （参见 P41）位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜
38、，有时也称为外壁。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（810nm ）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和 O-特异侧链（O-specific side chain，或称 O-多糖或 O-抗原）三部分组成。脂多糖的主要功能LPS 结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性；根据 LPS 抗原性的测定，沙门氏菌属(Salmonella )的抗原型多达 2107 种，一般都源自O-特异侧链种类的变化。这种多变性是革兰氏阴性细菌躲避宿主免疫系统攻击，保持感染成功的重要手段。也可依此
39、用灵敏的血清学方法对病原菌进行鉴定，在传染病的诊断中有其重要意义。LPS 负电荷较强，与磷壁酸相似，也有吸附 Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用，对细胞膜结构起稳定作用。类脂 A 是革兰氏阴性细菌致病物质 内毒素的物质基础；具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能；许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；C、外膜蛋白(outer membrane protein) 嵌合在 LPS 和磷脂层外膜上的蛋白。有 20 余种，但多数功能尚不清楚。孔蛋白（porins）是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约 1nm 的孔道，通过孔的开、闭，可对进
40、入外膜层的物质进行选择。非特异性孔蛋白可通过分子量小于 800900 的任何亲水性分子特异性孔蛋白只容许一种或少数几种相关物质通过，如维生素 B12 和核苷酸等。20脂蛋白(lipoprotein)是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋白，分子量约为 7200。D、周质空间(periplasmic space, periplasm) 又称壁膜间隙。在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约1215nm） ，呈胶状。周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所在周质空间中，存在着多种周质蛋白（periplasmic proteins）水解酶类；合成酶类；结合蛋
41、白；受体蛋白；（4）革兰氏阳性和阴性细菌的比较项 目 革 兰 氏 阳 性 菌 革 兰 氏 阴 性 菌 1、 革 兰 氏 染 色 反 应 能 阻 留 结 晶 紫 而 染 成 紫 色 可 经 脱 色 而 复 染 成 红 色 2、 肽 聚 糖 层 厚 ， 层 次 多 薄 ， 一 般 单 层 3、 磷 壁 酸 多 数 含 有 无 4、 外 膜 无 有 5、 脂 多 糖 （ LPS） 无 有 6、 类 脂 和 脂 蛋 白 含 量 低 （ 仅 抗 酸 性 细 菌 含 类 脂 ） 高 7、 鞭 毛 结 构 基 体 上 着 生 两 个 环 基 体 上 着 生 四 个 环 8、 产 毒 素 以 外 毒 素 为
42、主 以 内 毒 素 为 主 9、 对 机 械 力 的 抗 性 强 弱 10、 细 胞 壁 抗 溶 菌 酶 弱 强 11、 对 青 霉 素 和 磺 胺 敏 感 不 敏 感 21（参见 P44，表 3-2）革兰氏染色的原理 （参见 P46）5）特殊细胞壁的细菌：某些分枝杆菌和诺卡氏菌的细胞壁主要由一类被称为霉菌酸（Mycolic acid ）的枝链羟基脂质组成，后者被认为与这些细菌感染能力有关。用抗酸性染色对宿主体内的分枝杆菌病原体进行检测6）细胞壁缺陷细菌： （参见 P46）缺壁突变L 型细菌实验室或宿主体内形成 基本去尽原生质体（G+）缺壁细菌 人工去壁部分去除球状体（G-）在自然界长期进化中
43、形成枝原体（1）L 型细菌（L-form of bacteria）细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。因英国李斯德（Lister）预防研究所首先发现而得名（1935 年，念珠状链杆菌 Streptobacillus moniliformis）大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌和霍乱弧菌等 20 多种细菌中均有发现，被认为可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关。特点：没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态；有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌” ；对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在 0.1mm 左右） ；（2）原生
44、质体（protoplast ）在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。特点：对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂；有的原生质体具有鞭毛，但不能运动，也不被相应噬菌体所感染；在适宜条件（如高渗培养基）可生长繁殖、形成菌落，形成芽孢。及恢复成有细胞壁的正常结构。比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。（3）球状体(sphaeroplast) ，又称原生质球22采用上述同样方法，针对革兰氏阴性细菌处理后而
45、获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。与原生质体相比，它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长。（4）枝原体(Mycoplasma)在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。2、细胞膜1）概念：细胞质膜（cytoplasmic membrane） ，又称质膜（plasma membrane） 、细胞膜（cell membrane）或内膜（ inner membrane） ，是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约 78nm，由磷脂（占 2
46、0%30%）和蛋白质（占50%70%）组成。2）观察方法：质壁分离后结合鉴别性染色在光学显微镜下观察；原生质体破裂；超薄切片电镜观察；电镜观察到的细胞质膜，是在上下两暗色层之间夹着一浅色中间层的双层膜结构，这与细胞膜的化学组成有关。3）细胞膜的化学组成与结构模型：（1）磷脂 （参见 p47）在极性头的甘油 3C 上，不同种微生物具有不同的 R 基，如磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇等。非极性尾则由长链脂肪酸通过酯键连接在甘油的 C1 和 C2 位上组成，其链长和饱和度因细菌种类和生长温度而异。在生理温度下，脂肪酸末端排列成固定的晶格。不饱和脂肪酸的双键可导
47、致膜结构的变形。当磷脂分子中二者同时存在时，在一定条件下就阻碍了形成晶格结构所需要的有秩序排列。膜的流动性很大程度上取决于不饱和脂肪酸的结构和相对含量。细胞膜上长链脂肪酸的链长和饱和度因细菌种类和生长温度而异，通常生长温度要求越高的种，其饱和度也越高，反之则低。（2）膜蛋白亲水的极性端疏水的非极性端23具运输功能的整合蛋白（integral protein）或内嵌蛋白（intrinsic protein ）具有酶促作用的周边蛋白（peripheral protein）或膜外蛋白(extrinsic protein)膜蛋白约占细菌细胞膜的 50%70%，比任何一种生物膜都高，而且种类也多。-细胞
48、膜是一个重要的代谢活动中心。（3）液态镶嵌模型(fluid mosaic model)膜的主体是脂质双分子层；脂质双分子层具有流动性；整合蛋白因其表面呈疏水性，故可“溶”于脂质双分子层的疏水性内层中；周边蛋白表面含有亲水基团，故可通过静电引力与脂质双分子层表面的极性头相连；脂质分子间或脂质与蛋白质分子间无共价结合；脂质双分子层犹如一“海洋”，周边蛋白可在其上作“ 漂浮 ”运动，而整合蛋白则似“ 冰山”状沉浸在其中作横向移动。1972 年，辛格（J.S.Singer）和尼科尔森（G.L.Nicolson）（4）甾醇类物质由磷脂分子形成的双分子膜中加入甾醇类物质可以提高膜的稳定性甾醇的一般结构真核生物细胞膜中一般含有胆固醇等甾醇，含量为 5%-25%。原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇，而是含有hopanoid。hopanoid 类甾醇，其作用被认为也是稳定细胞膜的结构90%的化石燃料的前体物质是 kerogen（油原，或称油母岩质）Kerogen 中细菌特有的 hopanoid 类甾醇占有很高的比例Kerogen 是由于细菌的活动而形成在地下沉积物中细菌特有的 hopanoid 类甾醇的含量高达 1011-12 吨，与目前地球上存在的活的生物（living
