1、缺氧与高级别脑胶质瘤化疗抵抗和预后 的关系及高压氧舱临床疗效的初步研究 李春芳 张彩彩 海南省海口市人民医院高压氧科 海南医学院第二附 属医院神经外科 摘 要： 目的 探究缺氧与人脑胶质瘤细胞化疗抵抗及患者预后的关系及高压氧舱在高级 别脑胶质瘤患者中应用的疗效分析。方法 体外使用氯化钴诱导人脑胶质瘤细胞 U251缺氧状态, 蛋白印迹法 (Western blot) 检测细胞中缺氧标志物缺氧诱导 因子-1 (HIF-1) 的变化, 噻唑蓝 (MTT) 染色法检测U251细胞替莫唑胺 (TMZ) 的半抑制浓度 (IC50) 的变化。逆转录 PCR (RT-PCR) 检测患者高级别脑 胶质瘤组织中H
2、IF-1的表达特征, 比较与正常脑组织及低级别脑胶质瘤组织 表达的差异, 临床上采用 Kaplan-Meier生存分析法分析高压氧舱治疗与高级别 脑胶质瘤患者预后的相关性, 同时分析患者 HIF-1的表达与未行高压氧舱治 疗的患者预后的相关性。结果 体外成功诱导 U251细胞的缺氧状态, Western blot结果示 U251-ol 的HIF-1表达水平高于对照细胞 (U251-control) , MTT 结果显示, U251-ol 细胞TMZ的IC50值高于 U251-control (P0.05) 。未行高压氧舱治疗的高级别脑胶质瘤患者中, 高表达 HIF-1 的患者相比低表达的患者预
3、后不良, 差异有统计学意义 (P0.05) . The high-grade gliomas patients with high expression of HIF-1 who did not receive hyperbaric oxygen therapy had a poorer prognosis compared with the low-grade gliomas patients (P 5cm 胶质瘤 34Gy/次, 照射1518 次; (3) 高压氧治疗方案:在口服TMZ前2 h 行高压氧治 疗, 治疗稳压吸氧时长为 1 h, 压力为0.2 MPa, 高压氧治疗后1 h 内口
4、服TMZ。 对患者每2月进行 1次随访。 1.4 细胞培养及缺氧诱导 本研究人脑胶质瘤细胞 U251 (购自北京北纳生物技术研究院) , 使用含 10%FBS 的DMEM 培养基培养, 培养环境:37, 5%二氧化碳 CO2, 相对湿度100%。U251 缺氧细胞 (U251 oxygen lack, U251-ol) 及 U251对照细胞 (U251-control) 的诱导:接种 210个/孔的U251 细胞于10 cm 培养皿中, 待细胞生长至融合度为 50%时, 诱导U251-ol细胞的培养基中加入终浓度为 50mol/L的碳酸氯 (COCl2) , 对照组加入同等体积的磷酸盐缓冲液,
5、 处理24 h后收集细胞于1.5 ml 离心管中。 1.5 W estern blot 检测细胞 H IF-1 的蛋白表达 将诱导完成的U251 细胞消化离心后去上清液, (500l cell lysis buffer+55l 10cocktail) 冰上裂解2 h, 15 000 r/min, 4离心 15min, 收 集上清液BCA法检测蛋白浓度, 取50g蛋白行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 250 m A稳流湿转PVDF膜 2 h, 剪取目的条带10%脱脂奶粉封闭 2 h, HIF-1 抗体4 孵育过夜, 孵育浓度为 11 000, 第2天PBST 漂洗膜3次, 5 min/次, 鼠二抗
6、孵育1 h, 孵育浓度为 12 000, PBST漂洗膜 3次, 5 min/次, 发光液曝光显 影, Image Lab 4.2 检测印记吸光度, 待测蛋白样品吸光度值与内参基因 -actin 吸光度值的比值为样品相对吸光度。 1.6 M TT 检测细胞 TM Z IC 50值的变化 诱导方法同前, 将 U251-ol细胞及U251-control 细胞, 以210个/孔接种至 96孔板中, 37, 5%CO2培养12 h后 (期间仍持续诱导) , 弃上清, 加入不同 终浓度的TMZ与 (DMEM+10%FBS) 的混合液, 总体积200l/孔, TMZ 浓度设置 为:0.5、1.0、2.0
7、、4.0、8.0、16.0及32.0g/ml, 在相应浓度下处理 24 h, 弃 去原培养液, 将MTT溶液与培养基以19的比例混合后加入孔中, 避光孵育1 h, 多孔板酶标仪检测 570 nm处吸光度。绘制细胞生存曲线, 计算细胞半抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration, IC50) 。 1.7 逆转录 P C R 检测患者组织中 H IF-1的 m R N A 表达 液氮中取出组织并研磨成粉末, 取30 mg 加入 1 ml RNAiso Reagent 试剂, 冰上 裂解5 min, Trizol 法抽提总RNA, 50l无核酶水稀释 RN
8、A沉淀并混匀, 37 促溶, 5 min。Nanodrop 2000 超微量分光光度计检测 RNA浓度。取 1g总RNA 行逆转录, 得到c DNA 模板无核酶水稀释至 500l。逆转录PCR (reverse trans cription PCR, RT-q PCR) 体系配置10l SYBR Green 核酸荧光染料, 5l (10 ng) 模板 c DNA及5l 引物加入, 置于Applied Biosystems9700 PCR 仪中进行 定量分析, PCR反应条件:95预变性30 min, 95变性5 min, 60退火1 min, 95延伸 1 min, 共 40个循环。内参基因-
9、actin引物:正向引物 5-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3;反向引物5-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3。扩 增大小186 bp;HIF-1引物:正向引物5-CAGAA TGCTCAGAGAAAGCG-3;反向引 物5-TGGTCAGC TGTGGTAATCCA-3。扩增大小 264 bp, HIF-1的相对浓度与内 参基因的相对浓度比值作为目的基因 m RNA 的相对表达量。 1.8 统计学方法 数据分析采用SPSS 19.0 统计软件, 计量资料以均数标准差 表示, 行t检验或方差分析, 两两比较用SNK-q检验, Kaplan-Meier法绘制生存曲线,
10、 Log-Rank (Mantel-Cox) 检验两组患者预后, P0.05) 。见图 3。 图3 临床组织样本中 H IF-1m R N A表达的比较 下载原图 图3 临床组织样本中 H IF-1m R N A表达的比较 下载原图 图3 临床组织样本中 H IF-1m R N A表达的比较 下载原图 2.4 高压氧舱辅助治疗对高级别脑胶质瘤患者预后的影响 对行高压氧舱辅助治疗的观察组患者及未行高压氧舱辅助治疗的对照组患者进 行随访, 并绘制Kaplan-Meier 生存曲线, 结果显示高压氧舱辅助治疗能够改善 患者两年内的预后情况HR=0.359 (95%CI:0.131, 0.983) P
11、=0.022, 但对患者 长期疗效欠佳HR=0.513 (95%CI:0.309, 1.268) P=0.217。见图 4。 2.5 H IF-1 的表达量与高级别脑胶质瘤患者预后的关系 根据高级别脑胶质瘤患者肿瘤组织中 HIF-1 的表达量, 将未行高压氧舱辅助 治疗的33例高级别脑胶质瘤患者分为高表达 HIF-1组 (平均相对表达量 0.164) 和低表达HIF-1组 (平均相对表达量 0.164) , Kaplan-Meier分析 结果显示, 高表达 HIF-1的患者预后相比低表达患者预后不良, 差异有统计 学意义HR=0.369 (95%CI:0.137, 0.992) P=0.036
12、。见图5。 图4 高压氧舱辅助治疗与患者预后的关系分析 下载原图 A:观察组与对照组患者 2年内的随访结果;B:观察组与对照组患者长期随访结果 图5 H IF-1表达与患者预后的关系分析 下载原图 3 讨论 能量代谢异常是恶性肿瘤的特征表现之一6, 绝大多数恶性肿瘤生长迅速, 当 肿瘤体积1 mm时, 血管提供的氧及能量将不足以维持肿瘤的需要, 此时低氧环 境将促进肿瘤细胞发生糖酵解, 已有许多研究显示, 糖酵解的发生与多种恶性 肿瘤的增殖侵袭及化学耐药相关7。ZHOU 等8的研究显示, 脂肪酸合酶可通过促进乳腺癌细胞内的糖酵解, 使其侵袭能力的增强。MUKHERJEE等9发现, 胰岛素样生长
13、因子 1也可通过促进卵巢癌细胞的糖酵解介导细胞增殖能力增强。 ZHANG等10在结直肠癌细胞中发现核糖体蛋白 S7可通过抑制糖酵解使细胞增 殖侵袭能力减弱。WOO 等11在乳腺癌中证实, 糖酵解可参与肿瘤细胞他莫昔芬 耐药, 同时提出 HIF-1的过度活化在其中发挥重要作用:HIF-1 的活化可促 进糖酵解, 使细胞乳酸等酸性代谢产物水平增加, 产生的质子可拮抗弱碱性化 疗药物的疗效。HIF-1是肿瘤细胞缺氧时产生的一种核转录因子, 其基因定位 于染色体q14.24。近年有研究显示, 其可通过促进肿瘤细胞糖酵解相关酶的表 达, 增强细胞糖酵解能力, 使肿瘤细胞在内环境缺氧状态下能够维持生存,
14、并 促进肿瘤的恶性行为12-14。ZHANG15、SCHITO等16的研究及结论显示, HIF-1 可促进乳腺癌细胞的恶性行为, 并对肿瘤干细胞的形成具有重要作用。 TU等17的研究显示, HIF-1同样可促进骨肉瘤细胞的恶性表型, 其高表达不 利于患者预后。 AI18的研究发现, 在卵巢癌细胞中下调 HIF-1的表达可提高 细胞对顺铂的敏感性。上述研究均显示, 缺氧及 HIF-1在恶性肿瘤发生、发展 中起着重要作用, 但其与人脑胶质瘤关系尚不明确, 基于此, 笔者对人脑胶质 瘤中HIF-1的表达特征及其与化疗抵抗、 患者预后的关系进行探究, 并在临床 水平分析高压氧舱对高级别脑胶质瘤的疗效。
15、 研究结果显示, 体外诱导人脑胶质瘤细胞 U251 的缺氧状态后, 细胞 HIF-1表 达水平上升, 同时细胞相对TMZ的IC50值升高, 推测U251细胞缺氧发生时也可 通过上调HIF-1导致细胞糖酵解水平上调, 产生的酸性代谢产物使细胞对TMZ 耐药性增强, 该推测笔者将通过进一步实验验证, 改善缺氧肿瘤细胞外环境的 酸碱平衡, 探究其对细胞化疗抵抗能力的影响。同时观察高级别脑胶质瘤 HIF-1 的表达高于其在低级别脑胶质瘤及正常脑组织中的表达, 提示 HIF-1 可能在高级别脑胶质瘤的发生、 发展中发挥关键作用, 笔者将通过进一步的体外 实验, 探究 HIF-1 的确切生物学效应。 进而
16、在临床水平观察 HIF-1 的高表达 不利于高级别脑胶质瘤患者的预后, 进一步说明缺氧对于高级别脑胶质瘤的促 癌作用。 在研究中采用高压氧舱对高级别脑胶质瘤患者进行辅助治疗, 同时对患 者进行长期随访, 结果显示, 患者2年内生存率提高, 推测原因为:高压氧舱可 在短时间提高血浆中的氧分压和氧饱和度, 抑制肿瘤细胞内的糖酵解, 减少细 胞内环境中酸性产物的水平, 使得肿瘤细胞短时间内对 TMZ敏感性增强, 此时 患者行TMZ化学治疗, 效果优于未行高压氧舱治疗的患者。 但患者经过一段时间 的TMZ治疗后, 肿瘤细胞通过其他多种机制19不可避免的对TMZ耐药, 故高压 氧舱对患者长期生存率无提高
17、。 综上所述, 缺氧及 HIF-1与高级别脑胶质瘤的恶性程度、 化疗抵抗及患者预后 均存在密切关系, 高压氧舱治疗能显著对抗缺氧引起的促癌作用, 有利于患者 短期预后, 是值得推广的辅助治疗方式。 参考文献 1林昌海, 李丽仙, 冉静, 等.脑胶质瘤血液循环肿瘤标志物研究进展J.重 庆医学, 2016, 45 (30) :4293-4296. 2徐秋实.125例人脑胶质瘤病例预后因素的研究D.长春:吉林大学, 2013. 3HUANG D, LI C, ZHANG H.Hypoxia and cancer cell metabolismJ.Acta Biochimica Et Biophysi
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