不同途径输注造血干细胞对小鼠移植效果的比较.doc

1、 不同途径输注造血干细胞对小鼠移植效果的比较作者：蔡耘，黄绍良，黄科，陈惠芹，张绪超【摘要】 为比较骨髓腔内（IBM）或静脉（IV ） 等不同途径输注小鼠造血干细胞后在受体内的分布特点及对移植效果的影响，将57/6 胎鼠及新生鼠外周血(FNPB)单个核细胞（MNC）移植经亚致死量 60Co 射线辐照的BALB/鼠。受鼠随机分为 6组：单侧 IBM 组；双侧IBM 组；IV 组；双侧 IBM+IV 组；照射对照组；空白对照组。用组织冰冻切片和流式细胞术动态了解 CFSE 标记的FNPBMNC 在受体内的分布变化，观察移植后受鼠生存状况、植入水平、造血恢复及 GVHD 情况。 结果显示：IBM注射

2、的供体FNPBMNC 主要积聚于注射侧骨髓腔内，少量 FNPBMNC 可经血循环二次归巢，肺部滞留很少。单/双侧IBM 组输注的 FNPBMNC 总数无明显差异，但经双侧 IBM 输入 FNPBMNC 渗漏至外周血或其它组织器官的比例更少；IBM各组造血重建速度均优于 IV 组，尤以双侧 IBM 组最快，其外周血象和造血干祖细胞集落产率在移植后第 21 天已接近正常水平，单侧IBM 组、双侧 IBM+IV 组次之；IBM组各时点植入水平均明显高于 IV组，双侧 IBM 组注射侧胫骨植入水平与单侧IBM 组无明显差异，二次移植中双侧 IBM组的植入水平明显高于IV 组；IBM 移植组90 天存活

3、率80%， IV 组仅为 50%。 结论：双侧IBM 有利于 骨髓腔内输注移植 Comparison of Efficacies of Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantations between Different Routes of Administration in Mice Abstract When hematopoietic stem cells（HSCs）were admi nistrated by intravenous infusion (IV) , most of them were trapped in some

4、nonhematopoietic organs as like lungs that had abundant blood capillaries. Only a small fraction of injected cells could home to the bone marrow, which reduced the engraftment of HSCs. The purpose of intrabone marrow (IBM) transplantation was to facilitate the homing of HSCs directly. Based on the e

5、stablished murine model for allogeneic umbilical cord blood transplantation (UCBT) by IBM injection, the objective of this study was to pare the distribution of fetal and neonatal peripheral blood (FNPB) mononuclear cells (MNC) in vivo and the efficacy of HSCT by different routes of administration i

6、n mice. BALB/c recipient mice exposed to sublethal dose 60Co ray were transplanted with FNPBMNCs from 57BL /6 mice. Recipient mice were divided into six groups at random: unilateralIBM group; bilateralIBM group; IV group; bilateralIBM+IV group; irradiated control group and normal group. The distribu

7、tion of CFSElabeled FNPBMNCs in the recipients was observed in frozen sections of different organs or by flow cytometry. The survival rate, engraftment level, recovery of hematopoietic function and GVHD of recipient mice were studied. The results showed that infused by IBM route, FNPBMNCs mainly acc

8、umulated in the bone marrow (BM) cavity of the injected side tibia. Some of them could enter the BM of noninjected bones via blood circulation and few were trapped in the lung. Though same amount of FNPBMNCs were injected into recipient mice of unilateral and bilateralIBM group, less cells could lea

9、k into peripheral blood or other tissues when transplanted by bilateralIBM route. Therefore, in term of accelerating hemopoietic recovery, the injection of IBM route was better than IV route, especially bilateral IBM injection of HSCs, which neared the normal level of peripheral blood cells and colo

10、nyforming units of bone marrow nucleated cells at day 21 after transplantation, followed by unilateralIBM group and bilateralIBM+IV group. The percentages of H2Db cell subsets in the three IBM groups were much higher than that in IV group. There was no significant difference of the engraftment level

11、 in the injected side tibia between the unilateral and bilateralIBM group. When secondary transplantation was performed, the engraftment level in bilateralIBM group was still much higher than that in IV group. At day 90, the survival rates of IBM groups were all 80%, while that of IV group was only

12、50%. It is concluded that bilateralIBM route can facilitate the homing of more HSCs, accelerate the engraftment of HSCs and hematopoietic reconstitution, which promoted the efficacy of IBMHSCT. Key words intrabone marrow transplantation; intravenous transplantation; hematopoietic stem cell transplan

13、tation 外周静脉输注（intravenous injection， IV ）是广泛应用的造血干细胞( hematopoietic stem cell, HSC)移植途径。目前研究显示，IV 输入的 HSC 可滞留于富含毛细血管床的非造血组织，减少了骨髓归巢总量，从而影响 HSC 的植入效率，尤其是对于输入细胞数有限的脐血移植而言，其影响更大。2017 年 Kushida 等1首次报道旨在促进 HSC 归巢的骨髓腔内（intra bone marrow， IBM ）移植。本研究在前期建立的同种异基因小鼠骨髓腔内脐血移植模型基础上2，比较不同途径输注小鼠脐血替代品 胎鼠及新生鼠外周血（ fe

14、tal and neonatal peripheral blood， FNPB）细胞在受 体内的分布特点及对移植效果的影响，为临床应用提供实验基础。 材料和方法 实验动物 无特定病原体（SPF级）BALB/c（H2Dd ）雌性小鼠为移植受体，7-8 周龄，体质量 16-18 g，由中山大学实验动物中心提供；SPF 级C57BL/6（H 2Db）小鼠为移植供体，10-12 周龄， 体质量 22-25 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验小鼠置于无菌层流室动物洁净饲养柜中，饲料、饮用水及垫料均经高压灭菌处理，受鼠不添加抗生素或抗排斥反应药物，所有操作均在无菌层流环境中进行。 主要试剂 羧基

15、荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE） （Molecular Probes 公司产 品）、藻红蛋白（phycoer ythrin， PE ）或异硫氰 酸荧光素（fluorescein is othiocyanate， F ITC）标记大鼠抗小鼠 H2Db、CD117、Sca 1 单克隆抗体（美国 PharMingen 公司产品）、甲基纤维素半固体培养基 MethocultTMGFM3434(美国 Stem Cell 公司产品)、IMDM 干粉培养基（Gibco 公司产品），胎牛血清（Hyclone

16、 公司产品）、Nyco PrepTM 1.077A（AxisShi eld 公司产品）。 FNPB 细胞 的制备及原始造血干细胞检测 取胎龄 18-19 天胎鼠或出生 24小时内新生鼠外周血，按本室方法2制备单个核细胞（MNC）悬液， 用IMDM 培养液调整细胞浓度为 5106/ ml、3.310 7/ml、2107/ml、2.5106/ml 、1106/ml，于取血后 3 小时内移植受鼠。同时应用流式细胞仪检测同一孕鼠的 FNPB 和骨髓细胞中 CD117+ Sca1+表达情况。部分 FNPB 细胞以终浓度 10 mol/L 的 CFSE 染色，移植受鼠行体内示踪检查。染色后即时观察染色效果

17、，并置于 37、 5% CO2 及饱和湿度条件下培养 96 小时，观察荧光强度的变化。 动物分组及 FNPB 输注方法 BALB/c 雌鼠随机分为6 组， - 组每组 50 只， - 组每组 30 只。移植组每只受鼠接受FNPB MNC 1106 输注。单侧 IBM 组：右侧胫骨 IBM 注射；双侧 IBM 组：双侧胫骨各注射 FNPB MNC 5105；IV组；双侧 IBM+ IV组：双侧胫骨各 IBM 注射 FNPB MNC 2.5105+IV注射 FNPB MNC 5105； 照射对照组：单侧 IBM 注射 IMDM 培养液 30 l； 空白对照组：不照射，单侧IBM 注射IMDM 培养

18、液 30 l。- 组于移植前 8 小时接受 6.0Gy 的 60Co射线全身一次 性辐照，剂量率1.3 Gy/min。受鼠术前均以 43 g/L 水合氯醛 430 mg/kg 腹腔麻醉。IBM 注射时参照文献1略为改良，无需手术切口，直接用 1 ml UltraFineTM Needle 胰岛素注射器（29G 针头）行单侧或双侧胫骨腔注射。IV 注射时经尾静脉一次性注射FNPBMNC悬液。 CFSE 标记 FNPBMNC 体内示踪 CFSE 标记 FNPBMNC 输注后分别于5 分钟、24小时、72 小时随机选择单侧 IBM 组、双侧 IBM 组、IV 组各6 只受鼠，取眼静脉血涂片，注射侧胫

19、骨、股骨、肝、脾、肺、胸腺各行冰冻切片 5-10张，片厚 5 m，荧 光显微镜下 每片取 5-10 个非重叠视野，计数每个视野中荧光细胞数（100 ）。判定 标准为：（ ）每个视野未发现绿色或橙色荧光细胞；（ +）1-5个阳性细胞；（+）5-10个阳性细胞；（+）阳性细胞 10 个；（+ ）阳性细胞聚集成团块或云絮状，数量多而无法计数。另于上述时点制备受鼠脾脏、注射侧胫骨、股骨、外周血MNC 细胞悬液，FACS can 流式细胞仪检测绿色荧光细胞比例。 受鼠一般情况观察 每日观察 FNPBMNC 移植后受鼠生存情况至移植后 3 个月，绘制生存曲线。 受鼠造血重建的检测 移植后第10、14、21

20、、30 天用 KX21血细胞计数仪检测各组存活小鼠外周 血 WBC、Hb 、Pl t；同时取受鼠双侧胫骨、股骨骨髓有核细胞2104加入 1 ml 甲基纤维素半固体培养体系置于37、5% CO2及饱和湿度的培养箱中，按照文献3方法于接种后 7天计数CFUGM，14 天计数BFUE 、CFU GEMM，21 天计数CFUH PP； 第21 天处死各组存活受鼠，取注射侧胫骨及股骨行石蜡切片、HE 染色，光镜检查骨髓增生情况。 受鼠移植物抗宿主病检查 观察受鼠有无脱毛、腹泻、出血、皮肤黏膜溃烂等情况，取移植后出现 GVHD表现的受鼠和存活至第28 天的受鼠足垫皮肤、肝脏、肠管观察组织病理学改变。 受鼠

21、植入证据与植入水平检测 分别取第14、30、90天受鼠注射侧胫骨细胞悬液，FACScan 流式细胞仪检测 FITC 标记大鼠抗小鼠 H2Db 的表达情况，对照为 IgG1FITC。 二次移植实验 制备双侧 IBM 组存活 90 天以上受 鼠的胫、股骨骨髓细胞悬液，输入经同样剂量60Co射线辐照的BALB/c 雌鼠。12 只受鼠随机分为双侧IBM 组或IV组，每组 6 只，移植细胞数 5106。观察移植后受鼠生存情况，并于第60 天以流式细胞仪检测存活受鼠外周血中 H2Db+细胞比例。 统计学处理 计量资料以(均数标准差)表示。以 SPSS 11.5 统计软件作 t 检验或单因素方差分析及最小有

22、意义差异 t 检验，作 KaplanMeier 生存函数曲线及Log rank检验，检验水准设 =0.05。 结 果 C57 BL/6 鼠FNPBMNC 染色及原始造血干细胞检测结果 FNPBMNC 经CFSE染色后染色率95%（图 1），培养 96 小时后细胞形态、荧光强度无明显改变。流式细胞仪检测其 CD117+ Sca1+细胞比例为（3.731.29）% ，明显高于骨髓细胞（1.280.68）%的检测值（t =5.30，p0.01）（图 2）。 不同途径输注 FNPB 体内分布情况 CFSE 标记 FNPBMNC 输注后 5分钟 ，单、双侧 IBM 组注射处骨髓腔有许多绿色荧光细胞（+-

23、+），以单侧 IBM 组最多，其他部位未见带绿色或橙色荧光细胞。IV 组外周血荧光细胞（+），髓外组织（+）； 24 小时时， 单侧 IBM组注射部位的阳性细胞 Figu re 3. Tracing of CFSElabeled FNPBMNC in BM at 72 hours after transplantation（100）. A ：tibia of bilateral IBM injection group. B: injected side tibia of unilateral IBM injection group. C: femur of IV group. （+），外周血、

24、肺部 可见少量荧光细胞，而股骨、肝、脾、胸腺（+）。双侧 IBM 组注射处阳性细胞（ +），股骨、肝、脾、胸腺（+），肺及外周血（-）。IV 组骨髓腔内阳性细胞（+-+），外周血（+）， 其他组织（ +-+）；72小时时，单侧 IBM 组注射侧胫骨、股骨均可见荧光细胞，但仍以注射侧胫骨为多（+），其它部 位（-）或（+ ）。双侧 IBM 组胫骨中荧光细胞计数与24 小时情况相似，其它部位罕见阳性细胞。IV 组胫骨、股骨、肝、脾切片见阳性细胞少量，肺部仍为（+）（图 3 及表1）。 移植后 5 分钟, 流式细胞仪检测单侧IBM 组注射侧胫骨细 胞中（1.5370.136）%为CFSE 标记 FN

25、PBMNC，双侧 IBM 组两侧胫骨的检测值分别为（0.8430.160）%、（0.8130.106）%。两个 IBM 移植组经骨髓腔内注射的FNPBMNC 总数相同，双侧 IBM 组股骨、外周血、脾脏中阳性细胞比例均小于单侧组，但差异无统计学意义。两个IBM 移植组注射部位 骨髓中的供体细胞比例明显高于 IV 组（F= 183.66，p0.01），而股骨、脾脏、外周血中的分布则显着低于IV 组，提示IBM 注射的 FNPB MNC 即刻渗漏至外周血或其它组织的比例极少； 24 小时，两个 IBM 移植组注射侧胫骨中荧光细胞比例有 所下降，但仍显着高于股骨和 IV组，脾脏、股骨中的比例有所升高，以单侧 IBM 组较为显着，提示IBM 注射的 FNPB在该时已通 过血液循环到达其它组织，但大部分仍是“ 定居“于注射侧骨髓腔，尤其是双侧IBM 组在注射部位的分布比例最 高；72 小时时，单侧IBM 组注射侧胫骨供体的细胞比例为（0.8880.234）%，双侧 IBM 组相应比例分别为（0.6220.073）%、（0.6320.046）%，IV 组胫骨检测值仅为（0.0930.120）%，统计分析结果与 24 小时的情况一致(表 2)。