1、蛋白盐析实验步骤及注意事项 一、实验步骤：蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20 度时饱和溶液为 754 克/升；0 度时饱和溶解度为 706 克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。表 1 几种盐在不同温度下的溶解度（克 /100 毫升水）饱和硫酸铵法：1. 取 x ml 血清加 x ml 生理盐水，于搅拌下逐滴
2、加入 2xml 饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为 50%。2. 4，3h 以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以 xml 生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵 x/2ml。3. 置 43h 以上，此时，（NH4）2SO4 的饱和度为 33%重复上述第二步过程12 次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以 0.02%mol/L pH7.4PBS 溶解至 xml装入透析袋。4. 对 PBS 充分透析、换液 3 次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无 NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲
3、液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。二、注意事项：1. 盐析的成败决定于溶液的 pH 值与离子强度，溶液 pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。2. 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内 60 摄氏度烘干后再称量，这样更准确。3. 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。4. 盐析后最好搅拌 40 分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者 G-25，G-50 处理。6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在 70%左右。
