1、纳米荧光生物传感器研究进展及应用 冯婷婷 山西中医药大学 摘 要： 传统荧光生物传感器存在检测能力不强、 稳定性差的问题, 使得生物传感器的推 广、使用受限。纳米技术的出现促进了荧光传感器的发展, 使纳米荧光生物传感 器的检测能力大大提升, 具备高灵敏度、反应灵敏、专一性强、检测程序简单等 特点, 因此近年来纳米荧光生物传感技术发展迅猛。 本文分别概述了纳米荧光生 物传感器的分类及特点, 通过现有的科研成果展示了当前纳米荧光生物传感器 的技术发展水平, 着重分析并比较了当前生物传感器存在的关键问题。 结合近年 来纳米技术科研水平的提升, 基于纳米技术设计的纳米荧光生物传感器体系在 设计、 制备
2、、 空间结构、 性质及实用性方面的综合提升作用, 为新型选择性检测、 定向检测提供了解决途径并展望了未来纳米荧光生物传感器的发展方向及前景。 关键词： 纳米技术; 荧光生物传感器; 生物探针; 作者简介：冯婷婷 (1985) , 女, 山西长治人, 博士, 讲师, 研究方向:纳米 材料的制备用于生物传感分析、荧光探针的合成及其生物应用、用于细胞中酶的 检测等。 Research Progress and Application of Nanometer Fluorescence Biosensor Feng Ting-ting Shanxi University of Traditional
3、Chinese medicine; Abstract： Traditional fluorescent biosensor has the problem of low detection ability and poor stability which makes the promotion and use of biosensor limited. The emergence of nano-technology has promoted the development of fluorescence sensor, greatly enhanced the detection abili
4、ty of nano-fluorescent biosensor and has high sensitivity, responsive, specificity and simple detection procedure. Therefore, nanometer fluorescence biosensor technology has developed swiftly in recent years. In this paper, the general classification and characteristics of nano-fluorescence biosenso
5、rs are summarized and the current development of nano-fluorescent biosensors is demonstrated by the existing research results. The key issues of the current biosensor are analyzed and compared. The nano-fluorescence biosensor system based on nano-technology is designed to improve the level of nanote
6、chnology research in the design, preparation, spatial structure, nature and practicability. It provides a solution for the new selective detection and orientation detection. And the future development direction and prospect of nanometer fluorescence biosensor are prospected. Keyword： Nanotechnology;
7、 Fluorescence biosensor; Biological probe; 1 纳米荧光生物传感器发展历程 生物传感器的概念始于 20世纪 60年代, 直到 80年代, 全面而深入的研究才得 以开展, 在初始阶段的研究取得了丰硕成果, 在生物酶、DNA、Hg有毒重金属离 子等的检测有着大量实践。 生物传感器作为一种检测手段, 检测对象一般为生物 酶、DNA、抗原/抗体、细菌等活性物质, 以此作为识别对象的一类传感器1。 由于生物传感器有着比传统检测手段更高的灵敏度、更短的响应时间、更直观的 检测结果, 现已被深度开发, 广泛应用于生命科学科研工作、临床医学、微生物 学研究、环境监测治
8、理、司法鉴定等。但由于材料科学水平的限制、制备技术的 不成熟、 科研体系建立的不完善, 导致了当时生物传感器的响应检出能力并不理 想, 不能完全满足生物医学等其他学科的需求。随着扫描电镜、透射电镜技术的 发展, 纳米技术在20世纪90年代呈现出爆发式增长, 也间接促进纳米生物传感 器的进步。由于材料尺寸达到纳米级别时, 一般具备小尺寸效应、表面效应、量 子尺寸效应、介电限域效应及宏观量子隧道效应等特征, 使得比表面积显著增 大、 表面能增加, 材料表面的物理化学性质发生根本改变。 促进了各学科的进步, 延伸的研究领域十分广泛, 如纳米光催化技术、锂电池技术、传统金属加工技术 等。 其中生物传感
9、器辅予纳米技术为传感器的突破式发展提供了可行的方案, 现 有的研究成果中, 各体系类型的纳米生物传感器已被深入研究。 2 纳米荧光生物传感器分类 纳米荧光生物传感器是在纳米技术的手段下, 以纳米材料为主要载体, 来作为 新型生物传感器传输介质, 检测识别物质一般为酶、抗原/抗体、核酸、脂质体、 细胞、微生物等生物敏感性物质, 并以释放的荧光信号作为检测对象的分析体 系。 针对纳米荧光生物传感器中纳米材料的功能来划分, 可分为纳米荧光生物传 感器、纳米光纤荧光生物传感器及纳米光纤免疫生物传感器等。 3 纳米荧光生物传感器 传统荧光方法是采用有荧光效应的染料标记被检物体, 这种标记方法操作复杂,
10、操作者的技术水平直接影响着标记的效果。 标记成功率低, 荧光强度低以至于难 于检测发现;检测背景复杂, 对结果观察造成干扰, 会产生非相关显示。采用纳 米技术制备的生物传感器与目标物质有选择性结合的效果, 可以克服传统荧光 染料标记技术的缺点, 能够保证标记的成功率, 获得的检测荧光信号强, 便于 检测设备观察, 对灵敏度、 可靠性上有着明显的提升作用, 为生物医学领域中探 究特定物质提供可靠的技术手段, 其应用前景较好。 目前, 常见的纳米荧光生物 传感器类型有量子点类、包封荧光分子类、稀土及稀土配合物类等。 3.1 量子点荧光生物传感器 量子点纳米颗粒一般由- (如Cd Se, Zn S)
11、 、-族 (如Ga As, In P) 及 -族 (如Pb S, Pb Se) 元素组成, 目前研究最为深入的量子点体系为 Cd X (X=S、Se、Te) 系列。量子点由于特殊的结构尺寸 (110nm) , 有着优良的荧光 特性, 即高荧光量子产率、耐光漂白、相对狭窄而对称的发射光谱和大范围的连 续激发光谱以及长荧光寿命等, 由于量子点的优良荧光特性, 使得量子点处理 方式在生物传感器中应用较普遍。相较于荧光染料, 量子点产生的荧光强度、稳 定性、发光寿命均有明显优势, 特别适用于长时间的实时监测研究2。 针对体外游离物质的检测对象, Meng团队采用胆碱氧化酶、乙酰胆碱与量子点 相结合的方
12、式, 使最终的符合体系在量子效应的作用下, 对有机磷农药的检测 有较好的特异选择性, 检测灵敏度更高、体系稳定性好、对外部环境的耐受性大 大增强, 能够线性响应的浓度范围明显增强, 上述特征使得胆碱类-量子点体系 在有机磷农药的检测分析实用性上大大提升3。在水体氰离子监测领域, Noipa 团队设计了高选择性的纳米荧光生物传感器体系, 利用Cd S量子点自发荧光的 特点, 用半胱氨酸分子表面吸附处理, 由于表面半胱氨酸与铜离子特异性的结 合并发生明显的荧光猝灭现象, 与氰离子发生荧光恢复现象4。 半胱氨酸-量子 点体系保证了观察背景的高对比度;进一步研究证实, 荧光恢复程度与氰离子浓 度成线性
13、关系, 可直接定量氰离子浓度。 以上述针对体外监测对象现有的量子点荧光传感器体系不同, 体内纳米生物传 感器还应具备良好的渗透能力、定向靶标能力、可操作性及易分离等特性。为达 到体内物质检测的需求, 具有磁特性的纳米材料被引入生物传感器领域, 使其 具备精准的定向靶标能力、 可操作性及良好的分离效果, 减少对生物体的影响及 残留, 在生物医学领域应用广泛。 谢敏等将量子点基底材料与磁性纳米三氧化二 铁作为核结构, 将苯乙烯、丙烯酰胺的共聚体吸附于量子点-磁性材料表面, 改善表面理化性质, 增加该复合体系的生物相容性, 也为后续表面改性提供修饰 位点5。该团队将麦胚凝集素、花生凝集素、双花扁豆凝
14、集素嫁接于共聚体表 面, 制备了功能多样的磁性纳米荧光生物传感器、 该体系实验证实, 对细胞的糖 蛋白组分有较好的检测能力。 3.2 包封荧光分子类生物传感器 包封荧光分子类生物传感器将荧光染料、 量子点等物质封装起来, 保证了荧光物 质的稳定性, 使其具备良好的稳定性及强荧光效应。Si团队钙离子荧光染料与 多孔惰性的聚丙烯酰胺纳米粒子在超声的环境下, 组装为包封荧光分子生物传 感器6。基于聚丙烯酰胺良好的稳定性及表面游离化学键的作用, 该体系对荧 光染料的保护作用明显, 染料荧光强度衰减缓慢, 而且提升了生物传感器与胞 内蛋白质特异性结合的概率, 对细胞内游离的低浓度金属离子检出作用明显。
15、包 封荧光分子类的生物传感器在生理毒性上较量子点小, 对人体健康影响微弱, 故包封类生物传感器在生物医学监测领域有明显优势, 是生物医学研究的常用 手段。 3.3 稀土及稀土配合物类生物传感器 无机纳米稀土离子存在着吸收能力强、转换效率高、发射能力强、激发范围广、 性质稳定、易观察等特点, 有利于在生物分析的发光无标记。陈团队制备了氨基 功能化的KGd F4: (Eu、Tb、Dy) 磁性-荧光双功能多色纳米粒子, 在免疫分析中 应用广泛;但稀土配合物的理化性质变化较大, 发射的能量范围窄、斯托克斯位 移大、荧光强度稳定、寿命长等性质, 相较于纳米稀土离子体系, 经配合物修饰 后, 制成的荧光生
16、物传感器检出能力更强、更易于观察及判定7。Pihlasalo 巧妙运用Eu离子、Eu离子纳米化螯合物在 p H调节过程中, 荧光强度的改变曲 线, 可准确测量样品中蛋白质的等电点, 其检测限相较于传统的电场法所需浓 度更低、响应更灵敏。Harma团队在采用均相时间分辨荧光共振能量转移法时, 将Eu螯合物修饰的纳米粒子负载于聚苯乙烯表面, 进攻蛋白质、量子点核壳结 构, 能快速、准确检测出牛血清蛋白, 最低检测限下探至 10ng, 这种方法于生 物实验室的常规蛋白质的定量分析的应用潜力较大。 4 纳米光纤荧光生物传感器 纳米光纤荧光生物传感器发展较为迅速, 它具有体积小、荧光分析特异性强、灵 敏
17、度高、抗电磁干扰能力强、信息容量大等诸多特点。Kopelman于 20世纪90 年代设计了应用于荧光标记检测的纳米光纤传感器体系, 在微环境p H值的检测 领域最早应用。在提高灵敏度、小型化的探究上做了进一步研究:在做 DNA分子 探究实验时引入纳米金颗粒子, 灵敏度高、选择性好、成本低、易用性和快捷的 便携式传感器比其他 DNA检测手段的优势明显。 采用表面等离子效应带来的影响, 开发出适用于Cd离子定量检测的纳米光纤传感器, 金纳米颗粒与植物络合素及 肽链交联而成, 检测限达到了 0.16 ppb级别。纳米光纤荧光生物传感器具有无 需参比电极, 使用简便、 体积微小、 速度快、 可进行远距
18、离实时分析等诸多优点, 具有广泛的应用前景。 5 纳米光纤免疫生物传感器 为提高生物传感器与目标物质的结合特异性, 将光学、 光子学理论引入免疫学领 域, 利用抗原-抗体特异性结合的特点, 将抗原、抗体结合的光学变化量检测、 记录下来, 并采用纳米处理技术设计的一类生物传感器。 兼具传统免疫反应特异 性及传感器荧光标记的能力, 广泛应用于单细胞内部检测、监测试验。将 20nm 的蛋白与金纳米颗粒结合, 在局部表面等离子效益的作用下, 来探究体内抗原- 抗体的作用机理, 对血清中前列腺特异性抗原有较强的特异选择性。 6 展望 结合纳米技术带来的优势, 使得传统生物传感器能够保持/获得荧光特性,
19、大大 提升了检测信号的强度及持久性;由于纳米化处理使得生物传感器比表面积显著 提升, 为化学基团表面改性提供结合位点, 为选择性检测有毒金属离子、 细胞内 酶/蛋白质、抗原/抗体提供解决方案, 前期研究已取得丰硕成果。但进一步提升 纳米荧光生物传感器的灵敏度、选择性、生物相容性及检测范围仍是当前研究热 点。特别对于细胞内活性物质检测的生物传感器的研究中, 如何快速渗入、靶向 结合、可控分离是限制细胞内生物传感器广泛使用的重要因数。因此开发新型纳 米荧光生物传感器, 在检出能力、检测种类、细胞内检测上有明显提升是未来研 究的主要方向。 参考文献 1Gao ZQ, Agarwal A, Trigg
20、 AD, et al.Silicon nanowire arrays for labelfree detection of DNAJ.Anal Chem, 2007, 79 (9) :3291-3297. 2Dahan M.Time-gated biological imaging by use of colloidal quantum dotsJ.Optics Lett, 2001, 26 (11) :825-827. 3余涛, 应天翼.量子点生物传感体系用于胆碱酯酶抑制剂检测的研究进展J. 生物技术通讯, 2012, 23 (2) :280-283. 4Noipa T, Tuntulani
21、 T, Ngeontae W.Cu2+-modulated cysteamine-capped Cd S quantum dots as a turn-on fluorescence sensor for cyanide recognitionJ.Talanta, 2013, 105:320-326. 5谢敏, 胡军, 龙炎民, 等.凝集素修饰的三功能纳米生物传感器用于测定细 胞表面糖缀合物J.生物电子, 2009, 24 (5) :1311-1317. 6Si D, Epstein T, Lee Y E, et al.Nanoparticle PEBBLE sensors for quantitative nanomolar imaging of intracellular free calcium ionsJ.Anal Chem, 2012, 84 (2) :978-986.
